ELISA延伸内容浅析.ppt

ELISA延伸内容 by Cherish Kim 酶联免疫斑点试验 斑点酶免疫吸附试验 基于细胞法（cell-based ELISA） 方法学评价 斑点酶免疫吸附试验 （dot enzyme linked immunosorbent assay,Dot-ELISA） 又称 斑点免疫结合试验、抗原斑点试验及免疫斑点试验 实验原理： 同常规的ELISA，区别在于其所用载体为对蛋白质具有极强吸附力（近100%）的硝酸纤维素（NC）膜，此外酶作用底物后形成有色沉淀物，使NC染色。试验的结果可通过颜色斑点的出现与否和色泽深度进行判定。 DELISA常用检测方法：直接法、间接法、双抗体夹心法、双夹心法和竞争法等。 Dot-ELISA 原理示意图 技术要点 1. 膜包被后，一定要封闭确实，防止抗原或抗体的非特异性吸附，避免膜本底染色过深。 2.在待检抗体与NC膜上抗原结合后需洗涤后再滴加酶标二抗。 3. 结果判定时，应与阴、阳性对照斑点反复比较，尽量克服肉眼观察所带来的误差。 Dot-ELISA 应用 Dot—ELISA技术已成为微生物和传染病以及寄生虫病诊断最有前途且能标准化的技术之一，其用于检测牛和猪衣原体抗体已获得成功。 例：斑点酶联A蛋白免疫吸附试验-检测猪衣原体抗体方法 PPA：用葡萄球菌A蛋白(SPA)与辣根过氧化物酶(HRP)交联后冷冻干燥制成 的诊断试剂。（代替二抗体） SPA：（广谱诊断试剂）可与人和猪等多种哺乳动物血清IgG的Fc段结合。 优点： Dot—PPA—ELISA检测猪衣原体抗体具有灵敏度高、特异性好、简便快速(3 h内可完成)、携带寄送方便等优点，不需特殊检测仪器，结果易判断，反应膜片可长期保存，试剂用量节省，反应板可重复使用多次，制好的诊断膜片常温下保存时间长，因而适合在广大基层单位使用。 酶联免疫斑点试验 (enzyme linked immunospot , ELISPOT） 实验原理 在包被有待测CK抗体的微孔板上，加入可分泌相应CK的待测细胞，在有或无刺激物存在的条件下培养后，待测细胞向其周围分泌CK，CK被板上的特异性抗体捕获，在洗去细胞后用酶标记抗体为一抗（直接法）或二抗（间接法）。 T淋巴细胞 B淋巴细胞 细胞因子 加酶偶联的抗-Ig 加酶偶联的抗细胞因子 加入显色剂 加入显色剂 检测抗原特异性B细胞 检测产生细胞因子的T细胞 Ag包被的板 抗细胞因子包被的板 技术要点 1.选用底物应是在酶促反应后形成不溶性产物， 可在分泌CK的细胞相应位置上形成斑点，便于 观察和计数分泌CK的细胞。 2.选择的特异性抗体应具高亲和力、高特异性、低 内毒素的特性。 3.一个斑点代表一个CK分泌细胞，斑点的颜色深 浅程度与细胞分泌的CK量相关。 4.引入生物素-亲和素系统，可提高敏感性 ELISPOT 应用 在细胞因子检测方面应用较多的是IFN-γ的测定，IL-7和IL-15具有刺激IFN-γ分泌的能力，可增加检测敏感性。 检测Th1和Th2细胞可分泌不同CK种类，从而判断Th1/Th2细胞平衡状态表。 基于细胞法（cell-based ELISA） 是一种新的定性蛋白检测技术 原理 将细胞直接在微孔板里培养，待检测时，不需抽提蛋白和 裂解细胞，便可直接测量微孔板里蛋白经刺激或抑制作用 后的变化。 优势：无需裂解细胞，所以目标蛋白损失最少，可测定完整细胞、黏附细胞、还有非粘附细胞。 缺点：不能测定抗原量。 方法学评价 斑点酶免疫吸附试验（Dot-ELISA） 优点： ①灵敏度高，NC膜吸附蛋白力强，微量抗原吸附完全，故（是普通ELISA的6~8倍） ②操作简单，实验及结果判断不需特殊设备条件 ③长期保存，吸附Ag（Ab）或已有结果的NC膜在-20℃可保存长达半年，不影响活性 酶联免疫斑点试验（ELISPOT） 优点： ①侧重细胞检测, 弥补体液中CK 半衰期短的不足。 ②灵敏度高，当体液中某CK 含量较低时。 ③特异性高，可检测自发分泌细胞,和检测抗原特异性CK 分泌细胞。 ④单细胞水平，活细胞功能检测 缺点： ①比ELISA 技术复杂而费时, 需严密控制实验条件, 操作人员需技术熟练, 并能对实验结 果进行分析, 以减少实验偏差。 ② 属半定量方法, 试剂比ELISA 价格贵, ③当细胞产生大量CK时, 不宜选用ELISPOT , 而可选用ELISA。 谢 谢！