DGGE-TGGE浅析.ppt

TTGE技术指标： 温度控制器与加热器可使温度缓慢地以0.1℃/hr 的速度上升 无需化学梯度，电泳时间为5-8小时，使设置和制胶更方便 对照试剂与已证明有效的规程使你可以立即开展实验 分辨率高，温度梯度由微处理器控制，线性极为严格 重现性好，电泳条件（如温度、时间等）易于控制，可以保证电泳的重现性和结果的重复性 2. SSCP：单链构象多态性检测是一种基于DNA构象差别来检测点突变的方法。相同长度的单链DNA，如果碱基序列不同，形成的构象就不同，这样就形成了单链构象多态性。通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 PAGE ，可以非常敏锐地将构象上有差异的分子分离开。 操作过程是：①PCR扩增靶DNA；②将特异的PCR扩增 产物变性，而后快速复性，使之成为具有一定空间结构的单链DNA分子；③将适量的单链DNA进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳；④最后通过放射性自显影、银染或溴化乙锭显色分析结果。若发现单链DNA的迁移率与正常对照的相比发生改变，就可以判定该链构象发生改变，进而推断该DNA片段中有碱基突变。 优缺点：简便、快速、灵敏，不需要特 殊的仪器，适合临床实验的需要。不足之处，只能作为一种突变检测方法，要最后确定突变的位置和类型，还需进一步测序；电泳条件要求较严格；另外，由于SSCP是依据点突变引起单链DNA分子立体构象的改变来实现电泳分离的，这样就可能会出现当某些位置的点突变对单链DNA分子立体构象的改变不起作用或作用很小时，再加上其他条件的影响，使聚丙烯酰胺凝胶电泳无法分辨造成漏检。 3. CDGE：恒定变性凝胶电泳 Constant deratarared gel electrophoresis 是DGGE基础上发展起来的基因突变检测技术，亦是利用突变基因与正常基因 片段间Tm值的差异来检测突变的方法，该方法与DGGE的区别在于聚丙烯酰胺中含的 变性剂浓度相当于含突变基因片段的Tm值，而且浓度恒定，而不是线性递增. 　 DGGE/TGGE技术及其应用 一、概述 二、原理 三、仪器 四、特点 五、条件实验 六、应用领域 一、概述 DGGE：变性梯度凝胶电泳（ denaturing gradient gel electrophoresis）。 TGGE：温度梯度凝胶电泳（temperature gradient gel electrophoresis）。 DGGE最初是Lerman等人于20世纪80年代初期发明的，起初主要用来检测DNA片段中的点突变。Muyzer等人在1993年首次将其应用于微生物群落结构研究。后来又发展出其衍生技术-TGGE。此后十年间，该技术被广泛用于微生物分子生态学研究的各个领域，目前已经发展成为研究微生物群落结构的主要分子生物学方法之一。 二、原理 DGGE/TGGE技术是根据DNA片段解链温度的差异将长度相同，但序列不同的DNA片段分离开来。 相同序列的DNA片段，具有恒定的解链温度 Tm ，但若其序列发生改变，Tm值亦发生改变，在含有变性因素 变性剂， 高温 的凝胶中电泳时，当其双链解开形成分叉时，电泳迁移的速度就会大大降低，序列中出现单碱基替换时，Tm亦发生改变，电泳迁移率亦改变，此即DGGE/TGGE分离相同长度片段和鉴定突变的技术基础. 为了提高DGGE的突变检出率，发明者人为地加入一个高熔点区，就是在一侧引物的5′端加上一个30~40bp的GC结构，即GC夹（GC clamp）这样，在PCR产物的一侧可产生一个高熔点区，使相应的感兴趣的序列处于低熔点区而便于分析。因此，DGGE的突变检出率可提高到接近于100%。 乳杆菌（Lac-1，Lac-GC-2） 5-AGCAGTAGGGAATCTTCCA-3（19bp） 5-GCCCGGGGCGCGCCCCGGGCGGCCCGGGGGCACC GGGGG ATTYCACCGCTACACATG-3’（58bp）　　 分辨率高，可达到一个碱基 。 具有精密控温系统，比一般聚丙烯酰胺凝胶电泳具有更高的可重复性。可使电泳在5-70℃之间的恒定温度下进行（低于室温电泳需外接冷却装置），整块胶内的温差在0.5℃以内，控温范围45~70℃，加热器和温控部分可使温度最慢以0.1℃/h、最快以200℃/h上升。 能非常快速的对大量的混合标本进 行分析，如肠道微生物、土壤微生物群落结构等。进而克隆测序，比一般电泳仅仅根据片段长短进行分离前进了一大步。 几乎可以检出所有突变，无须对引物标记。解链温度取决于互补链的氢键含量和相邻碱基的引力，DGGE可以检测DNA分子中的任何一种单碱基的替代、移码突变以及少于10个碱基的缺失突变。 可将突变分子完好无损地同野生型分子分开用于进一步的分析。 可检测流感病毒基因多样性，遗传图谱分析，单核苷酸差异SNP检测。