脱病毒植株检测技术精讲.ppt

脱病毒植株的检测技术 一、直接观察法（非潜隐性病毒的鉴定） 概念：指示植物法就是利用病毒在其他植物上产生枯斑作为鉴别病毒种类的方法。 特点：条件简单，操作方便，经济而有效，它只能鉴定靠汁液传染的病毒，只能测出病毒的相对感染力。 (1)草本指示植物鉴定方法 1）汁液涂沫法 2）小叶嫁接法 (2)木本指示植物鉴定方法 1）直接在指示植物上嫁接待检植株的芽片 2）双重芽接法 3）双重切接法 二、指示植物法 ①采取汁液　在被鉴定植物上取1－3g幼叶，在研钵中加入水及少量0.1mol/L磷酸缓冲液（PH7.0），研碎过滤，再在汁液中加入少量的金钢砂（摩擦剂）。 ②接种　用棉球蘸取汁液在指示植物叶面上轻轻涂沬2－3次，后用清水冲洗叶面。 ③培养　在防蚜虫温室内培养，15－25 ℃ ，2－6天观察病症。 汁液涂抹法 木本指示植物鉴定方法 木本多年生果树及草莓等无性繁殖的草本植物，采用汁液接种法比较困难，则通常采用嫁接接种的方法。以指示植物作砧木，被鉴定植物作接穗，可采用劈接、靠接、芽接等方法嫁接，其中以劈接法为多。 三、抗血清鉴定法 植物病毒作为抗原，给动物注射后会在血清之中产生的抗体称抗血清。抗原与抗体间能发生高度专一性的血清学反应（免疫反应）。这样就可用已知抗血清可以鉴定未知病毒的种类，是目前最有用的方法之一。 特点：特异性高，测定速度快。 方法： 1）抗原的制备 2）抗血清的采收，分离 3）将抗血清与待测植物组织液混合。 4）鉴定　凝聚反应。（酶联免疫法最常用） 酶联免疫鉴定法（ELISA） 含义：酶联免疫法是指采用酶标记抗原或抗体的定量测定法(过氧化物酶或碱性磷酸酶) 。 间接法、双抗体夹心法、抗原竞争法 捕获包被法 ⑴将特异性抗原与固相载体连接，形成固相抗原 ⑵加稀释的受检血清⑶加酶标抗抗体 ⑷加底物显色 间接法 1.双链RNA法 通过提取纯纯化待测植物RNA，并对其进行电泳分析，可确定双链RNA存在，从而判断待检植物是否带病毒。2.互补DNA（c DNA）检测法 也叫DNA分子杂交法，核酸分子杂交（用放射性同位素（如32P）或生物素标记分子探针）。 四、核酸检测法 借助于电子显微镜能分辨0.5μm大小的病毒颗粒,采用电子显微镜既可以直接观察病毒，检查出有无病毒存在，病毒颗粒的大小、形状和结构，又可以鉴定病毒的种类。这是一种较为先进的方法。 优点:是灵敏度高和能在植物粗提取液中定量测定病毒 五、电镜观察法 超薄切片技术 负染色技术 免疫电镜技术