细胞蛋白磷酸酶1(PP1)活性定磷比色法定量检测试剂盒产品说.docVIP

细胞蛋白磷酸酶1（PP1）活性定磷比色法定量检测试剂盒产品说明书（中文版） 主要用途 细胞蛋白磷酸酶1（PP1）活性定磷比色法定量检测试剂是一种旨在使用特异性底物磷酸化，释放出游离磷酸根，与孔雀绿染料发生显色反应后，采用比色法测定其峰值的变化，以此进行测算单位酶活性的权威而经典的技术方法。该技术精心研制、成功实验证明的。其适合于各种细胞悬液的活性及其抑制剂的检测。广泛应用于细胞凋亡、蛋白组学、病理生理学、神经病变等研究。产品不含污染性蛋白酶，严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定，反应优化，检测敏感。 技术背景 蛋白磷酸化酶1（protein phosphatase 1；PP1；EC 3.1.3.），又称为1型蛋白丝/苏氨酸磷酸化酶，是7个主要丝/苏氨酸磷酸化酶（包括PP1、PP2A、PP2B、PP2C、PP4、PP5、PP6）成员之一，从酵母到人类高度进化保留。其参与调节多种重要的生理功能包括糖原代谢、细胞分裂、肌肉收缩、信号传导、神经元功能、转录、翻译等以及与HIV-1转录过程的调节并且与老年性痴呆等多种疾病密切相关PP1分子结构表面的3个凹槽及β 12-β 13 Loop环结构是底物与抑制剂的结合部位催化亚体为37kd，调节亚体有2种：目标亚体和抑制亚体。基于特异性底物糖原磷酸化酶a，在抑制剂福司曲星（）存在的情况下，受到蛋白磷酸化酶1的去磷酸化作用，释放出游离磷酸根，与孔雀绿（malachite green）染料发生显色反应后，在分光光度仪下（660nm波长）产生峰值的变化，由此测定蛋白磷酸化酶（PP）的特异活性。 产品内容 缓冲液（Reagent ） 毫升阴性液（Reagent ） 3毫升 反应液（Reagent ） 400微升 终止液（Reagent ） 毫升 显色液（Reagent ） 0毫升 标准液（Reagent ） 00微升产品说明书 1份 保存方式 保存缓冲液（Reagent ）液（Reagent ）、 反应液（Reagent ）和 显色液（Reagent ）在－20℃冰箱里，避免反复冻融；其余的保存在4℃冰箱里； 终止液（Reagent ）和 显色液（Reagent ）具有腐蚀性，避免直接用手接触； 显色液（Reagent ）避免光照，有效保证6月 用户自备 15毫升离心管：用于样品处理的容器 1.5毫升离心管：用于样品处理和保存的容器 细胞刮脱棒：用于贴壁细胞脱离 （微型）台式离心机：用于样品收集 培养箱：用于孵育反应物 比色皿：用于比色的容器 分光光度仪：用于比色分析 实验步骤 实验开始前，将－20℃冰箱里的试剂盒中的试剂溶液放进冰槽里融化。然后进行下列操作。 样品准备 准备好25cm2细胞培养瓶或60mm细胞培养皿的待测培养细胞（5 X 106细胞） 小心加入毫升预冷的 清理液（Reagent A），覆盖生长表面 小心抽去清理液 使用细胞刮脱棒轻柔刮脱细胞 加入毫升 清理液（Reagent A），混匀细胞 移入到预冷的15毫升锥形离心管（注意：悬浮细胞从这一步骤开始） 放进4℃台式离心机离心5分钟，速度为300g 小心抽去上清液 加入500微升 裂解液（Reagent B），充分混匀 转移到预冷的1.5毫升离心管 强力涡旋震荡15秒 置于冰槽里孵育30分钟 放进4℃微型台式离心机离心5分钟，速度为16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415） 小心移取500微升上清液到新的预冷的1.5毫升离心管 移取2微升进行蛋白定量测定（注意：建议使用 Bradford 蛋白质浓度定量试剂盒－30030.1）即刻放进－70℃保存或置于冰槽里继续后续操作测定准备 准备好待测样品（例如细胞萃取液等），置于冰槽里（注意：样品须澄清） 设定好分光光度仪（温度为30℃）：波长为660nm，并置零 准备好5个1.5毫升离心管，标记为1至5号管 分别加入 阴性液（Reagent ）标准液（Reagent ）到每个离心管混匀 将1至5号管放进冰槽里备用，避免光照；标准管浓度见下表管号 阴性液（Reagent ） 标准液（Reagent ） 标准磷浓度 1 0微升 0微摩尔2 25微升 微升微摩尔3 50微升 0微升微摩尔4 75微升 微升微摩尔5 100微升 0 0 标准曲线测定 移取10微升 阴性液（Reagent ）到新的比色皿 加入0微升上述配制的标准液 在30℃温度下孵育0分钟 加入60微升 终止液（Reagent ），混匀 加入800微升 显色液（Reagent ），混匀 室温下静置15分钟，避免光照 即刻放进分光光度仪检测：获得吸光读数 重复实验步骤1至四次 构建标准曲线：纵座标（Y轴）为吸光单位（A）；横座标（X轴）为标准磷浓度（摩尔） 样品测定 移取微升 缓冲