蛋白纯化protocol综述.docVIP

诱导表达 1、挑取含重组质粒的至ml?LB（含）培养基中37过夜培。 2、按1比例稀释过夜菌，一般将μl菌到含ml LB（含）培养基的ml试管中,?37震荡培养至OD6000.4－0.8（最好0.6，大约需hr，双抗大约需hr）。 3、取部分液体作为未诱导的对照组,余下的加入诱导至终浓度作为实验组,两组继续震荡培养hr。 4、分别取菌体ml,?离心1000 g × 1 min收获沉淀，用μl　蛋白loading　buffer重悬混匀5、离心1g × 5 min，取上清作为样品,可做SDS等分析。 1) 准备细胞，接种，诱导表达。对于实验室用的pET载体表达系列，在细胞OD600=0.4-0.8时，用IPTG诱导1-4小时，可以获得理想的表达效率。收集细胞，置于-20 ℃或立即进行步骤2操作。 2) 用Binding Buffer重悬清洗细胞，混匀，离心收集菌体。再加入1/20细胞生长体积的Binding Buffer，将菌体悬浮起来，混匀，冰上超声破碎细胞。 3) 10000 g，4 ℃离心20－30 min。取上清，置于冰上备用或-20度保存。 二、层析 1) 将处理好的NTA树脂装入合适的层析柱，将样品加到NTA层析柱中，流速控制在0.5-1 ml/min左右，收集流出部分，用于SDS/PAGE分析蛋白质的结合情况。 3) 用大约5倍柱体积的Binding Buffer