生化技术：3吸附层析教案分析.ppt

（三）装柱 1.干法装柱 直接加吸附剂至柱中，然后倒入溶剂 此法不易排尽气泡，容易导致层析不均匀 2.湿法装柱 先加适量溶剂至柱内，排走空气，然后将预先浸泡好的吸附剂搅均，随即将此混悬液倾入柱中（图3-5）；待其自然沉淀至柱高的1/4 ~ 1/3 时，打开下端出口，让溶剂慢慢流出，使柱子上端悬浮液徐徐下降至需要的高度；并用2~3倍量的洗脱剂流过层析柱，使其达到平衡 注：吸附剂表面要平整，应一直浸泡在溶剂液面以下，严防产生气泡。湿法装柱均匀，不易留有气泡 （四）上样和洗脱 ①经平衡好的层析柱，当平衡液到达固定相表面时，用滴管轻轻地将待分离样品液加置固定相表面（注意避免冲动基质，且样品液体积应小于床体积的1/2）；待样品液进入固定相时，用滴管加洗脱剂，并在上端连接洗脱剂瓶连续洗脱，同时下端与部分收集器接通，分级收集 ②将收集的每管溶液进行浓缩和活性测定。以管号或洗脱体积为横坐标，每管样品的浓度或活度为纵坐标，若层析峰无重叠，则各成分能完全分离（图3-7） ③为了获得满意分离效果，洗脱速度恰当控制（若太快，洗脱物在两相中平衡不完全；太慢，则洗脱物会扩散；结果都会导致分离度下降） ④分离出的样品经浓缩或冻干处理后，可进行纯度测定及保存 加 样 操 作 示 意 图 （五）柱子再生 各种层析柱，其再生方法因固定相不同而异 * * * * * * 第三章 吸 附 层 析