实验步骤方法详解.doc

第一章 DNA及RNA实验 第一节 组织和细胞RNA的制备 样品处理： 培养细胞：收获细胞×106，移入1.5ml离心管中，加入1mlTrizol，混匀，室温静置5min。 （3）组织：取50-100mg组织（新鲜或-70℃ 及液氮中保存的均可）置1.5ml离心管中，加入1mlTrizol充分匀浆，室温静置5min。 加入0.2ml氯仿，震荡15s，静置2min4℃离心，12000rpm×15min，取上清。 加入0.5ml异丙醇(或与上清等体积），将管中液体轻轻混匀，静置10min4℃离心，12000rpm×10min，弃上清。 加入1ml75%乙醇，轻轻洗涤沉淀。4℃，7500 rpm×5min，弃上清。 6、在室温中放置10min晾干，加入适量的DEPC水溶解（65℃促溶10-15min） 注意事项和Trizol的加入量一定要按步骤1的比例，不能随意增加样品量或减少Trizol量，否则会是内源性RNase的抑制不完全，导致RNA降解。℃中。 3、实验过程必须严格防止RNase的污染。要避免沉淀完全干燥，否则RNA难以溶解。试剂制备75%乙醇（DEPC配制）DEPC水 第二节 逆转录PCR 【使用Fermentas ReverAid First Strand cDNA Synthesis Kit】 1、取RNase-free的0.2微量离心管，冰上依次加入下列试剂的混合物至管中