植物原生质体培养和体细胞杂交-.ppt

* 对原生质体培养来讲，蔗糖不如葡萄糖。用葡萄糖代替甘露醇，可提高原生质体的植板率。 KM-P培养基，它包括丰富的维生素、氨基酸、有机酸、核苷酸、糖及糖醇等有机成分 。 不同植物原生质体对外源激素的种类和浓度的需求有很大差异，但总的来说，生长素和细胞分裂素是必需的，并需要二者的适当搭配。 较高的Ca2+浓度能提高原生质体的稳定性，这是由于Ca2+能保持原生质体质膜的电荷平衡。因此很多游高原生质体的酶液中都添加一定量的Ca2+和其他阳离子。在培养中，较高浓度的Ca2+对原生质体的生长发育同样有利。例如，豌豆原生质体在高Ca (5．3 mmol／L)中培养3、6 d，分别有10％、23％的原生质体再生细胞；而在低Ca2+(1 mmol／L)条件 下，分别只有3％、7％的原生质体再生成细胞。 * 原生质体在初期应在黑暗中培养；当形成愈伤组织时，需要强光照(2000~10000 lx)，以后甚至要强光照射才能满足生长的需要。 如柑桔类、猕猴桃等的原生质体培养较容易；葡萄原生质体的分离和培养从1974年就开始了，但到1990年才从欧洲葡萄悬浮细胞来源的原生质体 再生出植株；桃的原生质体培养至今仍只能得到愈伤组织。 * 荧光增白剂染色后置紫外显微镜下观察，细胞壁呈现明显荧光。细胞壁纤维素的β-1.4-葡聚糖链相结合 当形成两个新的细胞核的同时，在赤道板的位置出现了一个细胞板，细胞板由细胞的中央向四周扩散逐渐形成了新的细胞壁。 至于纤维素等组成是从哪个部位或哪种细胞器合成的，根据目前的了解，质膜是唯一可能承担这个任务的，从扫描电镜观察原生质体生长壁的过程来看，纤维素微纤丝的形成部位，必须是紧靠质膜的。 * 一般认为，原生质体融合首先必须使两个原生质体紧密接触，质膜之间的距离要小于10埃A。 * 但PEG对原生质有一定的毒害作用。 PEG分子具有轻微负极性，可与具有正极性基团的水、蛋白质和碳水化合物等形成氢键。当PEG分子链足够长时，它在相邻原生质体表面之间起分子桥作用，引发原生质体粘连。与膜相连的PEG分子被洗掉后，膜上电荷发生紊乱而重新分配。当两层膜紧密接触区域的电荷重新分配时，可能使一种原生质体上的带正电荷的基团连到另一种原生质体的带负电荷的基团上，导致原生质体融合。 * ．在应用PEG进行融合时，重要的影响因素是PEG的种类、纯度、浓度、处理时间、原生质体的生理状况和密度．近年来一些研究者建议在PEG 溶液中加入融合促进剂(如伴刀豆球蛋白，二甲基亚砜，链霉素蛋白酶等)，可以有效地提高原生质体融合的频率． Senda建立的电融合法发展迅速，是目前最流行的融合方法 * 利用融合细胞所具有的可见标记，在倒置显微镜下，用微管将融合细胞吸取出来进行选择的方法。 常用的可见标记为叶肉细胞的绿色。 应用荧光染料标记，在荧光显微镜下分离或用流式细胞仪分拣。 以亲本为对照进行形态特征、特性鉴定；最好要有明显的标记特征，如气孔大小及在叶背表皮上分布密度等。 * 是用FITC(异硫氰酸荧光素)和RITC(异硫氰酸罗丹明)将烟草叶肉细胞分别进行荧光标记。由于FIT℃ 在荧光显徽镜下呈绿色，RITC呈红色。 * 显带染色是将染色体经过一定程序的处理,并用特定的染料染色后,使染色体在其长轴上显示出一个个明暗交替或深浅不同的横纹,这样的横纹就叫做染色体的带。 每条染色体都含有一定数量、一定排列顺序、一定宽窄和染色深浅或明暗不同的带,这就构成了每条染色体的带型。显示染色体带的过程称为染色体显带。 染色体的染色技术可以分为普通染色和显带染色两大类。普通染色是将普通染料直接染色在染色体标本上。由于整条染色体都均匀着色,在显微镜下只能看到染色体的外形,看不清其内部结构,因此只能根据染色体的相对长度和着丝粒位置等外形体征来识别染色体 。 * * 在生物基因组中，DNA存在倒位、易位、插入、缺失、转座或排列不一的重复序列的现象，表现出DNA的多态性（polymorphism）。应用一定的检测技术就能够鉴定出不同种、品种间的DNA多态性（也称DNA分子标记或DNA指纹）。 原理RAPD（Random Amplified Polymorphic DNA），即随机扩增多态性DNA技术，是由美国科学家Wiliams和Welsh于1990年分别研究提出的，又称任意引物PCR。它的应用是基于这样的一个推理：对于同一模板DNA，用同一引物扩增既可能得到相同的带谱（模板基因组间可能具有同源性），也可能得到不同的带谱。仅在某一特定模板中出现的条带就可作为该模板的分子标记。事实上，不同基因组DNA总是一定差异的，所以用RAPD就可以进行分子标记研究。理论上讲，在一定的扩增条件下，扩增的条带数取决于基因组的复杂性。对特定的引物，复杂性越高的基因组所产生的扩增条带数也越多。 *