土壤酶的测定方法描述.doc

一、脲酶测定(苯酚钠-次氯酸钠比色法) 脲酶是对尿素转化起关键作用的酶，它的酶促反应产物是可供植物利用的氮源，它的活性可以用来表示土壤供氮能力。 1、试剂配制： pH6.7柠檬酸盐溶液：取368g柠檬酸溶于600mL蒸馏水中，另取295g氢氧化钾溶于水，再将两种溶液合并，用1N氢氧化钠将pH调至6.7，并用水稀释至2L。 苯酚钠溶液：称取62.5g苯酚溶于少量乙醇中，加2mL甲醇和18.5mL丙酮，后用乙醇稀释至100mL（A液），保存再冰箱中。称取27g氢氧化钠溶于100mL水中（B液），保存于冰箱中。使用前，取A、B两液各20mL混和，并用蒸馏水稀释至100mL备用。 次氯酸钠溶液：用水稀释制剂至活性氯的浓度为0.9％，溶液稳定。 10％尿素溶液：10g尿素溶于100mL水中。 N的标准溶液：精确称取0.4717g硫酸铵溶于水稀释至1L，则得1mL含0.1mgN的标液，再将此液稀释10倍制成氮工作液（0.01mg/mL）。 标准曲线绘制：分别取0、0.5、1.5、2.5、3.5、4.5、5.5、6.5mL氮工作液置于25mL刻度试管中，加蒸馏水至10mL，再加2mL苯酚钠溶液和1.5mL次氯酸钠溶液，随加随摇匀，20min后显色，定容25mL。1h内再分光光度计上于578nm处比色。 管号 1 2 3 4 5 6 7 8 工作液/ml 0 0.5 1.5 2.5 3.5 4.5 5.5 6.5 苯酚钠/ml 2 2 2 2 2 2 2 2 次氯酸钠/ml 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 蒸馏水定容 25 25 25 25 25 25 25 25 氨态氮量/μg 0 55 15 25 35 45 55 65 A578-1 0 0.054 0.148 0.263 0.339 0.433 0.514 0.569 A578-2 0 0.052 0.159 0.264 0.371 0.422 0.507 0.556 平均 0 0.053 0.154 0.264 0.355 0.428 0.511 0.563 2、操作步骤 （1）称取2.5ｇ土置于25mL刻度试管中, 加0.5mL甲苯处理,加塞塞紧轻摇15min;往瓶中加入2.5mL10%尿素液和5mL的柠檬酸盐缓冲液(ｐＨ6.7),仔细混匀。在37℃恒温箱中培养3ｈ。（当脲酶活性为3~80微克NH3-N时，本法能获得可靠的结果。若脲酶活性小于3微克，培养时间需增至24h）。 （2）然后用热至38℃的蒸馏水稀释至刻度(甲苯应浮在刻度以上),摇荡,将悬液过滤。对每一土样，设置用水代替基质的对照。对整个实验，进行无土壤基质的对照，以检验实验的纯度。 （3）取滤液0.5mL置于25mL刻度试管中,用蒸馏水稀释至5mL,然后加入2mL苯酚钠溶液,并立即加入1.5mL次氯酸钠溶液，加入每一试剂后,立即将混合物摇匀,20ｍｉｎ后,将混合物稀释至刻度, （4）在波长578ｎｍ处测定吸光值。脲酶活性以样品所得的吸光值减去对照样品吸光值之差,根据标准曲线求出氨态氮量。 3、结果计算 以3/24小时后1g土壤中NH3－N的质量（mg）表示脲酶活性（Ure） Ure＝a·V·n/m 式中：a为由标准曲线求得的NH3－N浓度（mg/mL）；V为显色液体积（50mL）0.5；n为分取倍数50；m为烘干土重（g）2.5。 注意事项： 每一个样品应该做一个无基质对照，以等体积的蒸馏水代替基质，其他操作与样品实验相同，以排除土样中原有的氨对实验结果的影响。 整个实验设置一个无土对照，不加土样，其他操作与实验相同，以检验试剂纯度和基质自身分解。 如果样品吸光值超过标曲的最大值，则应该增加分取倍数或减少培养的土样。 二. 过氧化氢酶测定(紫外分光光度法) 1. 试剂配制 a. 0.3％过氧化氢溶液：按1:100将30%H2O2用水稀释 b. 1.5N 硫酸：取42mL浓硫酸，稀释后定容至500mL c. 0.02N 高锰酸钾（1/5KMnO4）溶液：称取化学纯高锰酸钾3.161g，溶于1升无CO2蒸馏水中，贮于综色瓶中，备用。 d.饱和铝钾矾：十二水硫酸铝钾在20℃溶解度为10.84g,30℃的溶解度为15.41g 2. 操作步骤 （1）取2g风干土，置于100mL三角瓶中，并注入40mL蒸馏水和5mL 0.3％H2O2溶液（现配）。同时设置对照，即三角瓶中注入40mL蒸馏水和5mL 0.3％过氧化氢溶液，而不加土样。将三角瓶放在振荡机上振荡20min后，迅速加入饱和铝钾矾溶液1mL, 6000rad离心15min。取上清液9mL加入盛有1mL1.5N硫酸（以稳定未分解的过氧化氢），摇匀后。溶液在240nm处比色，测定吸光度As。同时做无土对照A0