第九章层析法解析.pptVIP

七．凝胶过滤层析法 凝胶过滤特别适用于水溶性高分子物质的分离，如蛋白质、酶、核酸、激素、多糖等发酵产物。 凝胶过滤的分离机理 含有不同组分的溶液，通过网状结构的凝胶粒子，小分子物质自由扩散于凝胶颗粒的缝隙中而进入凝胶相，大分子物质被排阻于凝胶相外，加入洗脱剂后溶液向下推移，大分子及剩余的小分子进入下层新的凝胶相中，重复上述扩散和排阻。 这样最先流出的洗脱液中含有最大分子物质，最后流出的洗脱液含有最小分子物质，分段收集可以获得各种相对分子质量大小的区段。 从上可见，凝胶过滤具有分子筛的作用，因而也称为分子筛层析法或排阻层析法。 八．正相与反相层析 这两种层析都是分配层析的扩展，基于流动相与固定相之间分配系数的差异，也就是说分配作用是由于溶质分子在惰性介质(固定相，一般为二氧化硅细颗粒)上的功能团与洗脱液中的溶解度不同而引起的相互作用所致。 在正相层析中，二氧化硅骨架上的基团是高极性的，因而洗脱液(流动相)也必须是高极性溶剂。 由于生物物质一般不能经受高极性溶剂的接触，因而在生化大分子物质的分离中较少应用。 反相层析与正相层析相反，采用的是非极性功能团(通常是碳链与惰性骨架相结合)的固定相，因而可用极性不高的缓冲液或有机溶剂作流动相。正因为这样，反相层析在生物物质的分离中使用很广。 九．亲和层析法 亲和层析法是利用高分子化合物可以和与它们相对应的配基，进行特异并可逆结合的特点来进行分离的。 把相应的一对配基中的一个通过物理吸附或化学共价键作用，固定在载体上使它变成固相，装在层析柱中来提纯其相对应的配基。 亲和层析法是依据生物高分子特异的生物学活性来进行分离提纯的，所以选择性很强，提纯效率大大提高。 一．塔板理论 塔板理论假定层析柱是不连续的，是由N个相同大小的混合接触器串联而成。 大多数塔板理论模型所共有的假设： ① 吸附过程是热力学上可逆的； ② 在相间，溶质的质量传递阻力可以忽略不计，也就是说溶质的分布平衡可瞬间达到； ③ 洗脱液连续通过板； ④ 在相邻板之间没有返混；对于第j级，溶质的质量平衡方程为： （9-10） 式中Vs和Vm分别为该级中固定相和移动相的体积； ⑤ 平衡等温线是线性的(Kd＝常数)； ⑥ 板是全部等同的，即Vs/Vm是常数。则式(8-12)可重新整理为： （9-11） 式中R为阻滞因素，其表示为 对方程式(9-11)积分，即可得到总的传递函数。 实际上，层析法是一个动态过程，在柱内任何一点上都不会达到平衡，所以色谱峰或色带会扩展和拖尾而不会陡峭。 它与平衡的偏离程度取决于相的物性，也取决于移动相沿柱方向的流动状况。 一般来说，理论板数将一个峰扩展的程度与在柱内的保留时间关联起来： （9-13） 式中 w＝4σt，是峰宽，在单位时间内实测或直接从实验洗脱曲线测定。 如果N是在一个长为L的柱中的塔板数，则每一块板的长度，即理论板的当量高度(HETP)是： （9-15） HETP参数在化学工程中应用非常普遍，表征相间质量传递的效果，但它不包含任何一个操作条件或者填充特性。 考虑到这些因素的影响，可以得到著名的Van Deemter方程式： （9-16） 其中A、B、C为Van Deemter方程式中参数。 溶质在两相之间的平衡分布阻滞有三个主要原因，在颗粒周围的液膜中外扩散、在颗粒里面内扩散和吸附动力学。 从方程式中可知，应存在某个流速使HETP最小而使柱效率最优。 从图中可见，最佳操作速度Uopt＝(B/C)1/2，此时层析柱的理论板数最大，分离效果最好。 在液相层析分离时，一般分子扩散的影响常忽略不计，即A值近似为零。 为提高分离效果，可采用降低流速u或减小固定相粒径即C值来提高理论板数目，降低HEPT。 减小粒径的办法可同时保证分离操作的高速度和高精度，这就是高效液相色谱（HPLC）分离的理论基础。 HPLC的固定相不仅粒径小，而且扩散路程短，很短的层析柱就具有很大的理论板数，对高速度、高精度的分析和分离非常有利。 二．层析的连续描述 就具有连续不断的洗脱剂流的连续床层的不连续本质而论，塔板理论备受争议。 基于洗脱剂的连续流通过床层、守恒定律、平衡定律、传递及反应的动力学定律以及边界和起始条件的使用，得到的往往是复杂的微分形式的的连续描述表达式。 如