第6章基因操作中大分子的分离和2013概论.ppt

总结 ◆ Southern印迹法（DNA印迹法,Southern blotting）：是一种把DNA电泳分离区带转移到支持膜上的技术。 ◆ Northern印迹法（RNA印迹法,Northern blotting）：Alwine等人将Southern印迹法应用于RNA，原理与Southern印迹法相似。 ◆ Western印迹法（蛋白质印迹法，Western blotting）：是一种从混合蛋白质中检出微量特定蛋白质的方法。 ◆ Eastern印迹法（Eastern blotting）：也是一种蛋白质印迹法，与Western印迹法不同之处是：先用等电聚焦-聚丙烯酰胺凝胶电泳（IEF）分离蛋白质，然后也是将蛋白质的分离区带、以电驱动转移方式进行了印迹。 一、RNA的S1核酸酶作图：分析原mRNA加工剪接为成熟mRNA中的剪切区段和边界。 二、S1核酸酶作图分析mRNA端点：5’和3’端均可分析。 三、引物延伸法分析mRNA的端点：只能用于5’末端的作图。 第四节 RNA作图和端点分析 自学 RNA的S1核酸酶作图 分析mRNA端点 引物延伸法分析mRNA的端点 第五节 重组DNA分子导入受体细胞 一 选择受体细胞的基本原则 二 重组质粒DNA转化大肠杆菌 基本概念 ● 受体细胞 receptor cell 又称为宿主细胞或寄主细胞 host cell 等，能摄取外源DNA并使其稳定维持的细胞。 ● 感受态 competence 细胞处于能够吸收DNA的状态，称为感受态。 ● 感受态细胞 competent cell 处于能够吸收DNA状态的细胞。 ● 细菌转化，是指一种细菌菌株由于捕获了来自另一种细菌菌株的DNA，而导致性状特征发生遗传改变的生命过程。 ● 转化子 transformant ：经转化获得外源遗传物质的细胞。 ● 转化 transformation :指将质粒DNA或以它为载体构建的重组质粒导入细菌中的过程。 ● 转染 transfection :指病毒及其重组子导入受体细胞的过程。 ● 转导 transduction :指噬菌体及其重组子导入受体细胞的过程。 一 选择受体细胞的基本原则 1、便于重组DNA分子的导入。 2、便于重组体的筛选。 3、遗传稳定性高，易于进行扩大培养或易于进行高密度发酵而不影响外源基因的表达效率。 4、受体细胞内源蛋白水解酶基因缺失或蛋白酶含量低。 5、安全性高，无致病性，不会对外界环境造成生物污染。一般选用致病缺陷型的细胞或营养缺陷型细胞作为受体细胞。 6、能使重组DNA分子稳定存在于细胞中。 7、受体细胞在遗传密码子的应用上无明显偏倚性。 8、具有较好的转译后加工机制等，便于真核目的基因的高效表达。 9、在理论研究和生产实践上有较高的应用价值。 二 重组质粒DNA转化大肠杆菌 （一） 氯化钙法 ● 1970年M. Mandel（曼德尔 ）和A. Hige发现，大肠杆菌经过氯化钙适当处理及短暂热休克之后，便能吸收λ噬菌体DNA。1972年美国斯坦福大学 S.Cohen（科恩 ）报道，经氯化钙处理大肠杆菌细胞也能摄取质粒DNA。 ● 原理是：细菌处于0℃和低渗氯化钙溶液中，细胞壁和膜通透性增加，菌体膨胀成球形，此时转化混合物中DNA形成抗DNase羟基-磷酸钙复合物粘附于细胞表面，经短暂热休克 42℃ 后，细胞膜形成许多间隙，DNA进入细胞内。 ● 如果感受态细胞做得好，每微克超螺旋质粒DNA可得5×107～1×109个转化子。 获得合格的感受态细胞，要注意以下几点： 1、用作受体菌的细胞在培养时要掌握好细胞密度，一般在A600为0.5左右为好。 2、制备受体细胞的整个过程在0～4℃进行，尽量避免污染。如果用抗生素筛选转化子，作为对照受体菌应该在此培养基上不生长。 3、为了提高转化率，可选用复合氯化钙溶液。 （二） 电穿孔法 电穿孔法 electroporation :是指一个较大的电脉冲短暂破坏细胞膜的脂质双层，从而允许DNA等分子通过细胞膜进入细胞，而后细胞膜快速复原，保持细胞的完整。这种方法称为电穿孔法。 最早应用于真核细胞，现在也可用于大肠杆菌的转化。 电穿孔转化法的效率受电场强度、电脉冲时间和外源DNA浓度等参数的影响； 通过优化这些参数，每μg DNA可以得到109～1012转化子。 研究表明，当电场强度和脉冲时间的组合方式导致50%～70%细菌死亡时，转化水平达到最高。 作业 1、琼脂糖凝胶电泳操作过程中的主要注意事项？ * 西南大学生物技术专业 基因工程 * * 西南大学生物技术专业 基因工程 * 醋酸钾，苯酚 氯仿抽提，乙醇沉淀 氯化铯-溴化乙锭平衡密度梯度离心法 聚丙烯酰胺 ×TE Buffer组成浓度：10