第六章生物催化剂的修饰与改造-详解.pptVIP

第六章 生物催化剂的修饰与改造 酶的结构和功能 酶蛋白的结构特征 酶蛋白和其他蛋白质一样，由20种基本氨基酸按一定的顺序排列，此即为酶蛋白的一级结构。 具有一定结构的多肽链以一定规则的氢键形成?-螺旋，?-折叠， ?-转角和自由盘绕等为二级结构。 这些二级结构单元进一步盘曲折叠，形成环状分子，即三级结构。 若酶蛋白具有四级结构，则必须具有两条或多条肽链。球状分子表面以疏水作用力、范德华力、氢键等非共价键互相连接起来，形成完整的酶分子。这些组成四级结构最小单位的肽键称为亚基。 大多数酶是结合蛋白质。除了多肽链组分外，还含有非蛋白组分，他们通常是各种低分子的热稳定性物质或离子（辅因子）。 酶蛋白+辅因子 全酶 酶蛋白分子水平的改造 基于序列的合理化设计（sequential rational design）,如化学修饰、定点突变（site-directed mutagenesis） 非合理设计（irrational design），利用基因的可操作性，模拟自然界的演化进程。如定向进化（directed evolution ）杂合进化（hybrid evolution） 酶分子的研究：认识和改造 认识酶，并利用各种生物化学、晶体学、光谱学等方法对天然酶或突变体进行研究，获得酶分子特征、空间结构、结构和功能之间的关系，以及氨基酸残基功能的信息。 以此为根据，对酶分子进行改造合理设计 不需要准确的酶分子结构信息，而通过随即突变、基因重组、定向筛选等对酶进行改造非合理设计 生物催化剂的化学修饰 酶分子修饰：酶蛋白分子的结构发生改变改变酶的某些特性和功能。 广义的说：蛋白质的修饰，通过化学基团的引入或除去—改变蛋白质的共价结构。 酶分子的完整空间结构：赋予酶的生物催化功能和特性，另一方面，导致酶的稳定性差、活性不高。 酶分子的修饰目的 人为的改变天然酶的某些性质：稳定性、创造天然酶所不具备的某些优良特性，扩大酶的应用范围。 酶修饰后：1）提高生物活性、2）增强在不良环境中的稳定性，3）新的催化能力。 如：脂肪酶和蛋白酶被MPEG修饰后，可溶于有机溶剂，催化酯合成、酯交换、肽合成。 如：a-胰凝乳蛋白酶表面的氨基修饰成亲水性更强的-NHCH2COOH后，抗不可逆热失活的稳定性在60C可提高1000倍。 如：对脂肪酶的CRL的非特异性化学修饰，大幅度提高立体选择性。 酶蛋白修饰的方法 物理修饰和化学修饰： 主链修饰 侧链基团修饰 组成单位置换修饰 金属离子置换修饰 大分子结合修饰 亲和修饰 生物大分子酶，组成单位主要是氨基酸和核苷酸。AA通过肽键连接成肽链，在通过盘绕折叠形成完成的空间结构。蛋白类酶的主链-肽链，是酶分子结构的基础。主链一旦改变，酶的结构和特性将随之发生改变。 主链的切断和连接-主链修饰：切断-酶原的活化，连接-1个酶分子上具有两种或多种催化活性的多酶融合体。 侧链的修饰：羧基的化学修饰、氨基、精氨酸胍基、巯基、组氨酸咪唑基、色氨酸吲哚基、酪氨酸残基和脂肪羟基、甲硫氨酸甲硫基的化学修饰 酶蛋白的固定化方法修饰 固定化可通过空间障碍、分配或扩散限制等效应影响酶的稳定性。 空间障碍使得其他大分子难于与酶作用，载体上的酶能抵抗蛋白水解酶的降解，固定化后也能抑制某些化学失活。 固定化后，微环境和游离酶有所改变，影响最始pH、底物专一性和动力学常数。如阳离子resin载体，最适pH升高；阴离子resin载体的固定化，最适pH偏低。 凝胶包埋：外部与内部传质都存在扩散效应，可以明显使酶更加稳定。如： a-胰凝乳蛋白酶包埋在PAA和PAGE凝胶中，60C时，提高1000倍。 酶蛋白的反胶束修饰 提供包埋酶的口袋，使酶微胶囊化，保护酶，使其在不利环境下有效发挥作用。 提高酶活，改变专一性。如：游离脂肪酶在油脂甲醇解反应体系，反胶束体系，活力、稳定性提高5倍。 大分子修饰剂的化学修饰 非共价修饰 使用一些能与酶非共价地相互作用而又能有效地保护酶的一些添加物，如聚乙二醇、右旋糖苷等，它们既能通过氢键固定在酶分子表面，也能通过氢键有效地与外部水相连，从而保护酶的活力。 一些添加物，如多元醇、多糖、多聚氨基酸、多胺等能通过调节酶的微环境来保护酶的活力。 另一类添加物就是蛋白质。蛋白质分子之间相互作用时，其表面区域内排除了水分子，因而增加了相互作用力，其稳定性也就增加了。 用可溶性大分子，如聚乙二醇、右旋糖苷、肝素等，通过共价键连接于酶分子的表面，形成一层覆盖层。 例如：用聚乙二醇修饰超氧物歧化酶 ，不仅可以降低或消除酶的抗原性，而且提高了抗蛋白酶的能力，延长了酶在体内的半衰期从而提高了酶药效。 每分子核糖核酸酶与6.5分子的右旋糖酐结合，可以使酶活力提高到原有酶活力的2.25倍； 每分子胰凝乳蛋白酶与11分子右旋糖酐结合，酶活力达到原有酶活力的5.