第4章蛋白质的共价结构解析.ppt

（一）肽的人工合成 保护（氨基、羧基、侧链活性基团） 活化（氨基、羧基） 缩合剂 （二）胰岛素的人工合成（三）固相肽合成 三、肽与蛋白质的人工合成 * * * * 2、化学裂解法 ①溴化氰水解法 Cyanogen bromide ——选择性地切割由Met羧基形成的肽键。 （五）、多肽链的部分裂解和 肽段混合物的分离纯化 多肽链的选择性降解 ②NH2OH断裂： 较专一性断裂Asn-Gly之间的肽键 Asn-Leu及Asn-Ala键也能部分断裂 3、肽段的分离纯化： 凝胶过滤、凝胶电泳和HPLC法 N-端分析法特点：能够不断重复循环，将肽链N-端氨基酸残基逐一进行标记和解离。 1、 Edman法 （六）、肽段氨基酸序列的测定 （苯异硫氰酸酯法） Edman于1950年首先提出。 PITC PTC-肽 2、氨肽酶法或羧肽酶法 3、质谱法（MS） 灵敏度高、所需样品少、测定速度快 ?电喷射电离串联质谱法 蛋白溶液→毛细管静电分散→ 带电微滴→ 质谱仪 玻璃毛细管 样品溶液 高压电 质谱仪 真空界面 分离 裂解 核糖体 蛋白质链 4.根据核苷酸序列的推定法 用待测蛋白质做抗原免疫动物，得相应抗体； 用此抗体去沉淀合成此种蛋白质得多核糖体； 从沉淀中分离出该mRNA，并将其反转录成cDNA 测出cDNA得核苷酸序列，并从它推出蛋白质的氨基酸序列。 （七）、肽段在多肽链中次序的决定 重叠肽（overlaping peptide） ?所得资料： 氨基末端残基 H 羧基末端残基 S 第一套肽段 第二套肽段 OUS SEO PS WTOU EOVE VERL RLA APS HOWT HO 末端残基 H S 末端肽段 HOWT APS 第一套肽段 HOWT OUS EOVE RLA PS 第二套肽段 HO WTOU SEO VERL APS 推断全顺序 HOWTOUSEO VERLAPS ?借助重叠法确定肽段次序： 胃蛋白酶处理没有断开二硫键的多肽链 经电泳分离各肽段 用过甲酸断开二硫键，含有-S-S-的肽段带电性质发生变化，转向90℃二次电泳，曾含二硫键的肽段迁移率发生变化 然后同其它方法分析的肽段进行比较，确定二硫键的位置 （八）、二硫键位置的确定 胃蛋白酶 最适pH约2，此时二硫键不断开 专一性低、肽段短 对角线电泳： ⑴把水解的混合肽段点到滤纸中央，在pH6.5的条件下，进行第一向电泳，肽段将按其大小及电荷的不同分离开来。 ⑵然后把滤纸暴露在过甲酸蒸气中，使-S-S-断裂。这时每个含二硫键的肽段被氧化 成一对含半胱氨磺酸的肽。 + - + - 第二向 第一向 a b 滤纸旋转90度角在与第一向完全相同的条件下进行第二向电泳。在这里，大多数肽段的迁移率未变，并将位于滤纸的一条对角线上，而含半胱氨磺酸的肽段比原来含二硫键的肽小而负电荷增加，结果它们都偏离了对角线。 肽斑可用茚三酮显色确定 + - + - 第二向 第一向 a b + - + - 第二向 第一向 a b Brown和Hartlay对角线电泳图解 pH6.5 图中a、b两个斑点是 由一个二硫键断裂 产生的肽段 二硫键位置的确定 （九）、蛋白质测序举例 （十）蛋白质序列数据库 同源蛋白质：来自不同生物体、 执行同一 /相似功能的蛋白质 同种蛋白质：来自相同生物体、 执行同一功能的蛋白质 1、同源蛋白质 二、蛋白质的AA序列与生物功能 （一）同源蛋白质的物种差异与生物进化 一百多个AA残基 MW约12.5×103 2 8个不变残基 细胞色素C的AA序列差异可用于核对各物种间的分类学关系以及绘制系统树/进化树。 2、细胞色素C与系统树 细胞色素C是真核细胞线粒体内膜上一种含Fe的蛋白质，在生物氧化中起传递电子的作用。通过植物、动物和微生物等数百种生物的细胞色素C一级结构的研究表明： （1）亲缘关系越近，AA顺序的同源性越大。 （2）尽管不同生物间亲缘关系差别很大，但与细胞色素C功能密切相关的AA顺序却有共同之处，即保守顺序不变 根据细胞色素 C的顺序种属差异建立起来的进化树 圆圈代表分歧点 1、氧合血红蛋白 （二）同源蛋白质具有共同的进化起源 该酶类活性中心的Ser残基起关键作用 胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、弹性蛋白酶、 凝血酶和纤溶酶 有序列同源性 对底物偏爱不同 2、丝氨酸蛋白酶类 卵清中的溶菌酶（lysozyme） α- 乳清蛋白（lactalbumin） ——三级结构很相似 也可能具有共同的祖先。 3、一些功能差异很大的蛋白质 （三）血液凝固与AA序列的局部断裂 凝血酶原 血液凝固：在凝血因子的作用下，可溶性的血纤蛋白原转变为不溶性的血纤蛋白网。 可溶性的 血纤蛋白原 酶 有活性的凝血酶 不溶性的