第7章蛋白质的分离、纯化和表征概论.pptVIP

吃柿子小心胃结石！ 年龄偏大的人，消化功能减退，多食易得柿石病。空腹也不要多吃柿子。 如果连皮一起吃更容易形成胃结石，皮中含的鞣酸更多。 含高蛋白的蟹、鱼、 虾在鞣酸的作用下， 很易凝固成块，形 成胃结石。 6.加热变性沉淀法 几乎所有的蛋白质都因加热变性而凝固。少量盐促进蛋白质加热凝固。 当蛋白质处于等电点时，加热凝固最完全和最迅速. 如：煮鸡蛋 卤水点豆腐 （少量MgCl2加入到大豆 蛋白质的浓热溶液中） 四、蛋白质分离纯化的一般原则 总目标：增加制品纯度或比活 1.前处理：因动/植物/细菌而异 2.粗分级分离：采用盐析/等电点沉淀/有机溶剂分级分离等方法 3.细分级分离：采用凝胶过滤、离子交换层析、吸附层析以及亲和层析等 4.结晶 五、蛋白质的分离纯化方法 一 根据分子大小不同的纯化方法 1、透析和超过滤 利用蛋白质分子不能透过半透膜将其 与小分子物质分开 半透膜为玻璃纸或纤维素材料 血液透析 小分子溶出 小分子被带出 透析机 透析液 加压 血液 2、密度梯度（区带）离心 60000~80000转/分 重力60万～80万倍 3、凝胶过滤 （二）利用溶解度差别的纯化方法 1.等电点沉淀 调整溶液pH 不同蛋白在各自 pI处依次沉淀 2.盐溶和盐析 3.有机溶剂分级分离法 降低介电常数 争夺水化膜 （三 根据电荷不同的分离方法—电泳 电泳 原理： 蛋白质在非等电点时所带总电荷不为0 分子大小不同，电场中移动速度也不同 （ 三）利用电荷不同的纯化方法 等电聚焦电泳 双向电泳 离子交换层析 （四）利用蛋白质选择性吸附的性质 羟磷石灰层析 疏水作用层析 （五）利用对配体的特异生物学 亲和力的纯化方法 亲和色谱颗粒 具有极强的专一性 六、蛋白质含量测定和纯度鉴定（略） * * * * * * * * * * * * * * * * * 第7章 蛋白质的分离纯化和表征 蛋白质含有酸/碱AA残基具有两性 碱/酸越大——pI 越大 pI通常在 6.0 左右 一、蛋白质的两性电离及等电点 蛋白质的等电点：当溶液在某一定pH值时，使某特定蛋白质分子上所带正负电荷相等，成为两性离子，在电场中即不向阳极移动也不向阴极移动，此时溶液的pH值即为该蛋白质的等电点（pI）。在等电点时，蛋白质的溶解度最小，在电场中不移动。 蛋白质电泳： 在外液pH低于等电点的溶液中，蛋白质粒子带 正电荷，在电场中向负极移动；在外液pH高于 等电点的溶液中，蛋白质粒子带负电荷，在电 场中向正极移动。这种现象称为蛋白质电泳— 带电粒子在电场中移动的现象。 蛋白质在等电点pH条件下，不发生电泳现象 利用蛋白质的电泳现象，可以将不同带电性质和不同大小、形状的蛋白质分子进行分离纯化。 根据蛋白质净电荷的差异来分离蛋白质的一种方法是电泳法。 电泳 蛋白质的分子量 一般在一万至一百万道尔顿之间 1道尔顿＝1×C12绝对质量/12 ≈1.66×10-27千克 二、蛋白质分子的大小 （一）根据化学组成测定最小分子量 1、测定蛋白质中某一微量元素的含量 2、假设蛋白质中仅含一个铁原子 最低相对分子质量 100* 55.8/铁的百分含量 （二）SDS－PAGE测定相对分子质量 蛋白质颗粒电泳时迁移率取决于： 所带电荷 分子量 分子形状 十二烷基磺酸钠 原态蛋白质 变性 ？ 磺酸基 极性亲水 烷基 亲油（蛋白质疏水区） 迁移率与电荷和形状无关，仅取决于相对分子质量 巯基乙醇破坏二硫键 （三）凝胶过滤法测定相对分子质量 蛋白质混合样 凝凝胶法只适于球状蛋白分子测量 三、蛋白质的胶体性质与蛋白质的沉淀 （一）胶体性质（colloidal system） 由于蛋白质分子量很大，在水溶液中形成直径1-100nm之间的颗粒，已达到胶体颗粒范围的大小，因而具有胶体溶液的通性。 蛋白质的水溶液能形成稳定的亲水胶体的原因： １、蛋白质多肽链上含有许多极性基团。 如：－NH3＋、－COO－ 、－OH、-SH、-CONH-等，它们都具有高度的亲水性，当与水接确时，极易吸附水分子，使蛋白质颗粒外围形成一层水化膜，将颗粒彼此隔开，不致因互相碰撞凝聚而沉淀。 2、蛋白质是两性电解质，在非等电状态时，相同蛋白质颗粒带有同性电荷，与周围的反离子构成稳定的双电层。使蛋白质颗粒之间相互排斥，保持一定距离，不致互相凝聚而沉淀。 蛋白质溶液由于具有水化层与双电层两方面的稳定因素，所以作为胶体系统是相对稳定的。 蛋白质胶体性质的应用 由于胶体溶液中的蛋白质不能通过半透膜，因此可以应用透析法将非蛋白的小分子杂质除去。 透析法：以半透膜提纯蛋白质的方法叫透析法 半透膜：只允许溶剂小分子通过，而溶质大分子不能通过，如羊皮纸、火棉胶、玻璃纸等 二.蛋白质的沉淀