刘殿武-肝病蛋白质组学2014.7预案.ppt

肝病蛋白质组学研究 蛋白质组学是干什么的？ 蛋白质组学研究解决 什么问题？ 差异否？ 蛋白质组学是干什么的？ 研究不同物种间差异 研究同种具有不同特征物种间差异 研究物种进化不同阶段的差异 物种间蛋白质差异 什么是蛋白质？ 蛋白质是一种复杂的有机生物大分子，它们是生命活动的实际执行者。 蛋白质由一个一个的氨基酸首尾相接形成肽链，肽链再折叠形成一定空间结构。 什么是蛋白质组？ 一、样品制备技术 蛋白样品制备的一般要求 1.应使所有待分析蛋白样品全部处于溶解状态，且制备方法应具有重现性。 2.保证样品在电泳过程中保持溶解状态，避免溶解性低的蛋白质在等点聚焦时由于溶解度降低而沉淀析出。 3.排除多糖、核酸、脂类其他干扰分子；同时避免处理环境对蛋白质的污染。 4.防止样品处理过程中发生蛋白质的化学修饰，包括蛋白质降解、蛋白酶或尿素热分解后引起的修饰； 5.尽量去除起干扰作用的高峰度或无关蛋白，保证待研究蛋白在可检测水平 6.尽可能缩短样品的处理时间，尽可能在低温环境中处理。 常用的处理方法 1. 细胞的洗涤 2. 细胞的破碎裂解 3. 除去污染物 4. 微透析 5. 电泳脱盐 6. 蛋白沉淀 1.细胞的洗涤 目的：去除污染物 常用的缓冲液：PBS 注意：保持适当的渗透压，避免细胞 溶解。 2.细胞的破碎裂解 不同的生物体或同一生物体的不同部位的组织，其细胞破碎的难易不一，使用的方法也不相同，如动物脏器的细胞膜较脆弱，容易破碎，植物和微生物由于具有坚固的纤维素、半纤维素组成的细胞壁，要采取专门的破碎方法。 各种细胞破碎方法的应用范围 4. 微透析 常用于小体积样品 膜的截留分子量8000Da 5.蛋白沉淀 目的：低浓度蛋白可以得到浓缩； 有时可以去除某些干扰物质； 抑制蛋白酶活性； 方法：硫酸铵沉淀法； 三氯乙酸沉淀法； 丙酮沉淀法； 丙酮/三氯乙酸沉淀法； 分离技术 2. 荧光差异显示双向电泳（Fluorescence 2D differential gel electrophoresis，F-2D DIGE） 这是一种定量分析凝胶上蛋白质点的新方法. 它是将待比较的两种样品提取的总蛋白质分别与两种不同的荧光标记试剂（Cy2、Cy3或Cy5）进行共价标记，然后将不同荧光染料标记的两种待比较的蛋白质样品等量混合，上样进行双向电泳，2D凝胶在成像仪上用两种不同波长激发，并将两种样品的荧光图谱显示成像，用2D分析软件进行定量分析。将定量上显示有明显差异的蛋白质点切下后进行鉴定分析，从而确定差异表达的蛋白质。 Application in Treatment 白血病： 白血病是血液系统的常见恶性肿瘤，临床上分型较多，而不同的亚型之间，所用的治疗方案不同，其预后结果也不相同，所以白血病的分型显得尤为重要。 为了明确急性白血病FAB分型中所涉及的关键蛋白，对61 例急性白血病患者进行筛查，发现髓系相关蛋白8和14仅在M2和M3型中高表达。因此，这两种标志物蛋白可以作为急性髓系白血病（AML）分型标志蛋白，有利于选择正确的治疗方案。 Application in Treatment 直肠癌： 蛋白质组学技术可用于直肠癌手术前分子分期，对判断结直肠癌的淋巴结转移、远处转移有重要意义。徐文鸿等应用SELDI-TOF-MS，分析了76 例结直肠癌患者的血清标本，建立并验证了分期模型。通过SELDI-TOF-MS 技术所筛选的候选肿瘤标志物可以指导大肠癌的综合治疗，所建立的诊断模型可以辅助临床明确大肠癌的术前分期。 Investigation and Identification of disease-related peptide in sera from patients with chronic hepatitis B 慢性乙肝相关肝病差异蛋白的查找 4210Da蛋白 4210Da蛋白急性乙肝病人血清蛋白质组的追踪观察 慢性乙肝轻、中、重型患者血清蛋白质组的比较 1866Da蛋白 1866Da蛋白在合并组和重型组具有明显差异 慢性乙肝（CHB）、肝硬化（LC）、肝癌（HCC）患者血清蛋白质组的比较分析 根据氨基酸序列，4210Da蛋白被鉴定为“Gene_Symbol GSPT2 Eukaryotic peptide chain release factor GTP-binding subunit ERF. 1866Da蛋白经检索鉴定为补体3的一个片段 4210Da多肽功能研究 Fig.2 eRF3b 蛋白在各种细胞株中的表达. A eRF3b 和eRF3a 序列的比对，阴影部分多肽作为抗原用于抗体制备. B eRF3b在转染 pEFGP-C2 C2 , p