8第八章基因工程下游技术解析.ppt

3. 细胞外分泌表达 将蛋白质分泌到细胞外是人们最期望的一种策略。因为这样容易纯化目的蛋白质，减少细菌的蛋白酶对目的蛋白质的降解。 2011-10-30 * 基因工程下游技术 4. 融合蛋白表达 在E.coli中表达外源蛋白，尤其是真核蛋白时，蛋白质的稳定性是经常遇到的问题。最近几年，众多巧妙的蛋白质——融合系统的发展，为E.coli中高效表达和纯化重组蛋白提供了极大方便。 融合表达具有多方面的优点： 防止包涵体的形成 促进蛋白质的正确折叠 限制蛋白酶解和利于纯化 2011-10-30 基因工程下游技术 * 融合表达体系 谷胱甘肽S－转移酶（GST） 麦芽糖结合蛋白（MBP） 硫氧还蛋白（Trx） 融合蛋白中目的蛋白的回收 位点特异性裂解的方法：溴化氰(Met↓)、 羟胺(Asn↓Gly)等试剂或低pH(Asp↓Pro)来进行融合蛋白的化学裂解。 酶解：反应条件较温和，所用蛋白酶具有高度的特异性，如凝血酶、肠激酶、凝乳酶和胶原酶等。所有这些酶都具有较长的底物识别序列，从而降低了蛋白质中其他无关部位发生断裂的可能性。 五、实例：粒细胞—巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)下游生产工艺流程 菌种划板及扩菌 2011-10-30 * 基因工程下游技术 75L发酵罐扩菌诱导,流加补料 离心收集菌体 高压匀浆破菌，洗涤提取包涵体 溶解包涵体，Sephacryl S-200分子筛柱层析 复