5. Gene_isolation_New.pptVIP

* 酵母的双杂交系统示意图 * 该法是一种用于分离和鉴定差异表达基因的方法,特别适宜于那些差异表达量很低的基因,其富集效率在1000倍以上. 主要步骤： i. 利用SMART或常规方法制备待测ds-cDNA（tester cDNA）和驱动ds-cDNA（driver cDNA） ii. 用限制酶RsaI酶切2种Cdna,获得具有平端结构的ds-cDNA片段 iii. 将待测cDNA样品分为两份,分别与2种不同的匹配接头相连接.两接头的5’端序列是相同的,而其3’端则是不同的 7. 抑制消减杂交法（SSH, Suppression Substraction Hybridiazation) * iv. 每份待测cDNA样品中加入过量的驱动cDNA,加热变性后再复性,形成a、b、c、d 4种分子,a类分子包括等量的高丰度和低丰度序列.由于非目的DNA已与驱动cDNA形成了c类分子而使差异表达的基因序列大大地富集了—第1轮PCR v. 将第1轮杂交的样品进行第2轮杂交:将2种样品混合后再加入驱动cDNA,被富集的a类分子可形成b、c、e等3类杂交分子,e类分子是由2个具有不同单链匹配接头的双链待测cDNA组成,该类分子是被大大富集了的差异表达基因 vi. 整个群体分子经过第2轮PCR反应:补平末端和差异表达基因的扩增vii. 扩