2-外源基因在毕赤酵母中高效表达的预测和sds聚丙烯酰胺凝胶电泳.pptVIP

NGAL核酸编码区序列及其相应的蛋白序列： 由N 端的310螺旋、C 端的α螺旋和中间的八段反平行式β折叠构成了一个β折叠桶结构； 在β折叠桶底部内侧排列着疏水的芳香族和脂肪族氨基酸残基，形成了一个疏水核或疏水内部，为结合亲脂性配体提供了位点； NGAL 在其β折叠桶封闭端的β4-β5 环上有游离的巯基 C87 ，这可使NGAL 与一些蛋白质分子，如MMP-9，形成分子间二硫键，并以此来调节这些蛋白的功能或活性。 NGAL的蛋白三级结构（图为NGAL蛋白的同源二聚体）： 以往，汕头大学医学院生物化学与分子生物学教研室李恩民教授课题组利用大肠杆菌原核表达系统获得了NGAL蛋白，但是由原核表达系统对外源蛋白没有类似真核细胞中的蛋白修饰，如磷酸化和糖基化，有可能影响这些蛋白在功能研究实验中的效果，为此，我们选择了毕赤酵母这种真核表达系统来表达NGAL蛋白。 由大肠杆菌表达获得的NGAL蛋白 实验步骤 获得含目的蛋白的酵母上清 SDS电泳 蛋白质印迹 利用毕赤酵母表达系统进行NGAL蛋白外源表达进行验证的实验技术路线： 构建表达载体→转化至酵母菌中→筛选阳性转化单克隆→筛选高表达单克隆 挑单克隆于培养液 振荡培养3～5天，加甲醇诱导目的蛋白的表达 离心 酵母上清 将玻璃板用蒸馏水洗净晾干, 准备2个干净的小烧杯； 把玻璃板在灌胶支架上固定好，放好密封条和隔离板, 固定玻璃板时，两边用力一定要均匀，防止夹坏玻璃板; 按照下表配制12％分离胶与4％浓缩胶； 样品的制备：样品和标准蛋白分别与5倍上样缓冲液按5：1的比例混匀，并在100度沸水浴中煮5min，取出待用； SDS凝胶的制作 分离胶 12% 浓缩胶 4% 超纯水 3.3 ml 3 ml 30% Acr/Bis 4 ml 0.66ml Buffer 1.5mol/L pH 8.8 Tris-HCl 2.5ml 0.5mol/L pH 6.8 Tris-HCl 1.25ml 10% SDS 100 μl 50 μl 10% Ap 50 μl 25 μl TEMED 5 μl 5 μl 凝胶的成分 聚丙烯酰胺具有神经毒性，操作时要戴手套 按比例配好分离胶,用移液管快速加入，大约5厘米左右,之后加少许蒸馏水（或异丙醇除泡），静置至胶凝固； 凝胶配制过程要迅速, 催化剂TEMED要在注胶前再加入，否则凝结无法注胶。注胶过程 最好一次性完成，避免产生气泡； 水封的目的：保持分离胶上沿平直，排气泡； 胶凝好的标志：胶与水层之间形成清晰的界面； 倒出水并用滤纸把剩余的水分吸干，按比例配好浓缩胶，连续平稳加入缩胶至离边缘5mm处，迅速插入梳子，静置到胶凝固。 梳子需一次平稳插入，梳口处不得有气泡,梳底需水平。 拔出样梳后,拆掉密封条，在内槽中加入缓冲液； 上样： marker 5 μl 样品20 μl + 5×上样buffer 5μl 共25μl 上样时要记清上样的顺序 微量注射器不可过低,以防刺破胶体；也不可过高, 样品下沉时易发生扩散，溢出加样孔 接通电源，100V恒压电泳，至溴酚蓝距凝胶边缘约0.5～1cm时，约2.5h，停止电泳； 凝胶的处理： 剥离与染色：电泳结束后，撬开玻璃板，剥胶时要小心,保持分离胶完好无损,将分离胶做好标记后放在大培养皿内，加入考马斯亮蓝染色染色液，染色约4h；染色后的凝胶板用脱色液脱色0.5h，直到蛋白质区带清晰。 蛋白质印迹操作 将PVDF膜先置于100%甲醇中浸湿15s，然后移至超纯水中浸泡2min，最后转至转移液中至少平衡5min； 电泳完毕的凝胶，剥落到转移液中平衡30min，将转印用的滤纸和海绵垫均用转移液浸湿； 将夹子打开使黑的一面保持水平，在上面垫一张海绵垫，用玻棒擀走里面的气泡，在垫子上垫2张10×10 cm的滤纸，用玻棒擀去其中的气泡； 从转移液中取出平衡好的分离胶盖于滤纸上，用玻棒擀去气泡，将平衡好的PVDF膜盖于胶上，并去除气泡； 在膜上盖2张7.0×8.0 cm的滤纸并除去气泡，最后盖上另一个海绵垫，擀几下就可合起夹子； 将夹子放入转移槽槽中，60V转移2h，将膜用超纯水漂洗一下，室温晾干； 蛋白质印迹操作步骤 蛋白印迹系统 免疫检测的操作 将膜用100％甲醇浸湿5min，再用超纯水漂洗一下，移至含有50ml封闭液的平皿中，室温下脱色摇床上摇动封闭1h； 将一抗（大鼠抗人NGAL单克隆抗体）用封闭液1：200稀释；铺保鲜膜于实验台面，将抗体溶液（每张膜500μl液体）加到保鲜膜上； 从封闭液中取出膜，用滤纸吸去残留液后，将膜蛋白面朝下放于抗体液面上，室温下孵育2h； 用PBST在室温下脱色摇床上漂洗两次，每次5min，再用PBS漂洗一次，5min； 二抗（山羊抗大鼠IgG HRP）用封闭液1：2000稀释并