原生质体诱变方法.docVIP

2.4 试验方法 2.4.1 酶液配制 称取适量固体酶（w/v ，溶于0.6mol/L渗透压稳定剂中，0.22μm微孔过滤膜过滤除菌后备用。 2.4.2菌丝培养 取直径1cm的菌丝块接种于盛有100mL液体培养基的250mL三角瓶中，每瓶接种一块，25℃静置培养3-7d。 2.4.3原生质体制备与计数 将培养好的菌丝置于离心管中，10000r/min离心15min，弃去上清液，用相应稳渗剂洗涤3次，无菌滤纸吸去多余水分。每250mg湿菌丝加1mL酶液，在适当温度水浴中酶解一段时间，酶解过程中每隔一段时间震荡混匀一次，吸取少许酶解液，血球计数板计数。 原生质体制备是菌种选育及其遗传研究的一个重要组成部分，确定了滑菇原生质体形成的最适条件：以0.6mol/L的MgSO4为稳渗剂，在2%的蜗牛酶和纤维素酶的混合酶、pH6.5、酶解温度30℃的条件下对培养7d的菌丝进行酶解，在此条件下所得原生质体的产量为3.92×106个/mL。6个/mL，取 5mL 放于无菌的 9cm 平皿内，置于电磁搅拌器上，使原生质体悬液保持均匀。紫外灯功率 15W，照射距离 30cm，照射 0－100s。 照射后适当稀释，取 1mL 涂平板，黑暗闭光于 25℃恒温箱中培养，待平板长出菌落后，计菌落数，并计算原生质体紫外线诱变的半致死剂量。 1.5.2.2 冬虫夏草原生质体诱变效应曲线及紫外线诱变剂量的选择 取 22 个 9cm 平皿，每皿分别装有新制备的 106个/mL 的冬虫夏草原生质体悬液5mL。 共分为 11 组，每组 2 个重复。紫外灯功率 15W，照射距离 30cm，分别照射 0、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100s。然后分别每皿取 1mL，适当稀释后涂再生平板。 平板用黑布包裹后，置于黑暗闭光的 25℃恒温箱中培养。待平板长出菌落后，计菌落数。 每组以两个皿菌落数的平均值作为该组的菌落数。以照射时间为横坐标，以再生菌落数为纵坐标，绘制冬虫夏草原生质体紫外诱变剂量效应曲线。 1.5.3 冬虫夏草诱变株的筛选 以半致死剂量对应的紫外线照射剂量诱变冬虫夏草原生质体，连续诱变 20 批，每 批稀释后涂 10 个平皿。待原生质体在平皿上再生出菌落后，取优先再生出来、生长最旺盛的菌落，转接入 PDA 培养基平皿内。采用三点接种法，每皿分别接种 2 株诱变菌株和 1 株原始出发菌株，根据拮抗反应和生长状况筛选出 100 株诱变菌株。 1.5.4 虫草多糖含量测定 1.5.4.1 液体菌种制备 分别取 100 株诱变和原始出发菌株直径 10mm 的菌种块接入盛有 100mL 液体种子培 养基的 250mL 三角瓶中，25℃，160r/min 振荡培养 4d，得液体培养液。 1.5.4.2 胞外多糖（EPS）含量测定 1.5.4.2.1 苯酚溶液的配置 称取 50g 苯酚于 1000mL 容量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，置棕色瓶中，配成 5 ％苯酚溶液，避光保存。