土壤生态修复相关酶指标测定.docVIP

土壤生物化学指标测定 土壤脱氢酶(dehydrogenase)活性测定（比色法） 分析意义 脱氢酶能酶促脱氢反应，它起着氢的中间传递体的作用。在土壤中，碳水化合物和有机酸的脱氢酶作用比较活跃，他们可以作为氢的工体。脱氢酶能自基质中析出氢而进行氧化作用。 方法选择与原理 Lenhard(1956)最先提出用TTC作为氢的受体生成红色的TF，进行闭塞测定，以溶液的光密度值表示酶活性。 后来对上述的方法做了不同的改进和完善。用土壤有机质作为氢的供体或用葡萄糖做氢的供体，用生成的TF数量或换算成氢的体积来表示脱氢酶的活性。 试剂配制 1、0.5%TTC溶液 2、甲苯 3、Tris-HCl缓冲液Ph7.6：0.1M三羟甲基氨基甲烷（12.114g/L）50ml 与0.1MHCl 38.5ml混合后，用水稀释至100ml。 4、硫化钠 5、0.1mol/L葡萄糖溶液。 （四）实验步骤 1、标准曲线的绘制：称取相当于50mg纯品量的已烘干的TTC于50 ml比色管中，定容，制成1 mg/L的母液。分别向6支50ml比色管中依次注入0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6mL mg/ml标准 TTC溶液，用蒸馏水定容至5mL。 在试管中依次加入2 mL Tris-HCl缓冲液，2mL蒸馏水，2mL TTC系列溶液，对照组不加TTC，再各加入1 g低亚硫酸钠，摇匀，待溶液充分显色后，各管准确加入5ml甲苯，振荡萃取2min，取上层有机溶液在紫外分光光度计492nm处闭塞绘制标准曲线。 2、操作过程：取1g新鲜土壤，置于50ml 比色管中，依次加入4mlTris-HCl盐酸缓冲液、2ml 0.1mol/L葡萄糖溶液、1ml 0.5% TTC溶液,震荡均匀，离心（4000转/分）5分钟后，将甲苯提取液在分光光度计492 nm处闭塞测定。同时设无土壤和无TTC的对照（以蒸馏水替代）。 3、结果计算：脱氢酶活性=TF含量/0.5g — 土壤含水量 脱氢酶活性，以24h后1g干土中 TF的生成量表示。 过氧化氢酶（Catalase activity）活性测定（滴定法） 1. 试剂配制 0.3%过氧化氢溶液100mL：取1mL30%的过氧化氢溶液，在100mL容量瓶中定溶至100mL即可。 3N硫酸。 0.1N高锰酸钾溶液500mL：取7.9015g高锰酸钾溶于蒸馏水中，稀释至500mL，即得0.1N的高锰酸钾溶液。 2. 操作步骤 取2g土壤样品，置于100mL三角瓶中，并注入40mL蒸馏水和5mL0.3%过氧化氢溶液。将三角瓶放在摇床上，振荡20min。而后加入5mL 3N硫酸，以稳定未分解的过氧化氢。再将瓶中悬液用慢速滤纸过滤。然后，吸取25mL滤液，用0.1N高锰酸钾溶液滴定至淡粉红色终点，所消耗的高锰酸钾量（mL数）记为B；另取一管不加土样作对照，按上述方法操作，即滴定25mL原始的过氧化氢混合液，所消耗的高锰酸钾量（mL数）记为A。 3. 结果计算 以20min 后1g土壤的0.1N高锰酸钾滴定的毫升数表示过氧化氢酶活 性。即A-B为过氧化氢酶活性。单位：mg KMnO4·g-1·min-1。 土壤脲酶（urease）活性的测定（比色法） （一）分析意义 脲酶广泛存在于土壤中，是研究的比较深入的一种土壤酶。脲酶酶促产物————氨是植物氮源之一。尿素氮肥水解于脲酶密切相关。有机肥料中也有游离尿美的存在。同时脲酶与土壤其他因子（有机质含量、微生物数量）有关。研究土壤脲酶转化尿素的作用及其调控技术，对提高尿素氮肥利用率有重要的意义。 （二）方法选择及原理 脲酶是一种转性较强的酶。它能酶促尿素水解成氨、二氧化碳和水，Rotini(1935)，首先提出研究测定土壤脲酶，研究证明，中型介质中脲酶活性最强。故测定土壤脲酶时，一般采用中性缓冲体系，也有的研究者也用碱性缓冲液测定脲酶。测定土壤脲酶均采用尿素做基质，浓度范围为2——10%。 （三）试剂配制 1、PH6.7柠檬酸缓冲液：取368g柠檬酸溶于600ml蒸馏水中，另取259g氢氧化钾溶于水，再将二种溶液混合，用1NNaOH讲PH调至6.7，并用水稀释至2L。 2、苯酚钠溶液：称62.5g苯酚溶于少量乙醇中，加2ml甲醇和18.5ml丙酮，然后用乙醇稀释至100ml（A液），保存在冰箱中，称27g氢氧化钠溶于100ml水中（B液），保存在冰箱中，使用前，取A、B两页各20ml混合，并用蒸馏水稀释至100ml备用。（各12ml，混合，稀释至60ml，使用之前混合！） 3、次氯酸钠溶液：用水稀释制剂，至活性氯的浓度为0.9%，溶液稳定。 4、10%尿素液。 5、甲苯 6、氮的标准溶液：精确称取0.4717g硫酸铵溶于睡并稀释至1000m