生化制备技术.doc

1. 激活蛋白AP-1是由组Fos和Jun蛋白组成的，它通过调节基因的表达来应对多种刺激。试设计从Hela细胞中分离纯化AP-1的实验方案并说明理由。 从Hela细胞中分离纯化AP-1的实验方案 从Hela细胞中分离纯化AP-1的实验步骤如下： Hela细胞 ↓低渗膨胀细胞Dounce氏匀浆低速离心 细胞核 ↓0.42mol/Lkcl提取 高速离心 硫酸铵沉淀 核提取物 ↓s300凝胶过滤 S300峰组分 ↓序列特异性DNA亲和层析 部分纯化的AP-1 图示：从Hela细胞中部分纯化AP-1的实验流程图 实验一：Hela细胞核提取物的制备。 在本实验中，基本上是按照Dignam等所述的方法从Hela细胞中制备核提取物的。 首先，将Hela细胞置于低渗缓冲液中孵育，细胞体积因渗透膨胀作用而增大。 然后，将膨胀的细胞置Dounce氏匀浆器中匀浆使之裂解，离心收集细胞核。 然后，将细胞核置于含0.42mol/L KCl的缓冲液中孵育，提取转录因子AP-1。 然后，100000g离心1小时，将溶解状态的转录因子AP-1与细胞核的包膜及基质分开，所得上清液即是细胞核提取物。 最后，用硫酸铵沉淀上清液中的转录因子AP-1，再重悬于层析缓冲液中，离心去除不溶物后，即可加载于SephacrylS-300凝胶柱进行层析。 注：1.将Hela细胞置于液氮中冷冻保存，温度为-80℃。 2.在细胞核的制备过程中，除了特别的说明以外，所有溶液均应保存于4℃，所有操作应在4℃下进行。 实验二：SephacrylS-300HR凝胶过滤层析 首先，取5mlHela细胞核提取物样品进行凝胶过滤层析，留取50μL提取物供随后的测活分析用。 然后，对XK26/40柱，采用下列柱参数：直径 2.6cm,柱长 34cm,体积 180ml,流速 100ml/h，缓冲液 TM缓冲液+0.1mol/l KCL。 然后，于S-300柱加5mlHela细胞核提取物样品，分部收集5ml组分。 然后，从S-300柱洗脱所得的各组分留取50μl等分试样，供DNA酶Ⅰ足迹分析实验用。 然后，各组分在24小时内使用，可储存于4℃；若长期保存，则需液氮保存于-80℃以下。 然后，用DNA酶Ⅰ足迹法测定各组分中的AP-1的DNA结合活性。 最后，含AP-1活性峰的S-300柱组分可直接上序列特异性DNA亲和层析柱。 注：1.所有操作均在4℃环境下进行。 2.凝胶过滤层析的关键一步是样品进入填料床。 3.蛋白质溶液的冻融是蛋白质化学研究能否获得成功的重要环节之一。 实验三：序列特异性DNA亲和层析 首先，纯化序列特异性DNA结合蛋白AP-1。 然后，非特异性DNA结合蛋白的误纯化。在Hela细胞提取物中，用DNA亲和层析纯化的蛋白质组分中常见的杂蛋白质有两种：一种是聚腺苷二磷酸核糖聚合酶，分子量为116000Da；另一种是Ku抗原，由分子量为70000Da和80000Da两种多肽组成。 然后，亲和层析前DNA结合蛋白AP-1的部分纯化。有几项注意事项对DNA结合蛋白AP-1的纯化很有用的：离子交换层析，肝素-琼脂糖是一种很通用的介质，非特异性DNA-纤维素和DNA琼脂糖凝胶，不含待分离转录因子结合位点的序列特异性DNA亲和介质，麦胚凝集素亲和层析，凝胶过滤层析。 最后，亲和层析用寡核苷酸序列的确定。以下几点很重要：寡核苷酸的长度，5′突出端，寡核苷酸序列与DNA酶Ⅰ足迹的关系，合成寡核苷酸的纯度，亲和介质的蛋白接合容量，纯化AP-1和Sp1用的寡核苷酸（1.用制备的凝胶电泳纯化寡核苷酸：使用的是聚丙烯酰胺凝胶，样品以及DNA的回收。2.DNA亲和介质的制备：寡核苷酸的5′-磷酸化，寡核苷酸的连接，偶联Sepharose用DNA制备，用溴化氰将DNA偶联于Sepharose，用CNBr活化的Sepharose将DNA偶联于Sepharose。3.亲和层析中非特异性竞争DNA的正确使用：竞争DNA的选择以及用量估算，竞争DNA的制备。4.亲和层析的操作：全部操作在4℃下进行。 讨论： DNA酶Ⅰ足迹分析与凝胶迁移率变动分析优缺点比较： DNA酶Ⅰ足迹分析技术如下： 序列特异性结合因子与一单端标记的双链DNA探针一起孵育，使该因子与DNA片段上它的识别位点相结合。然后，能使每条双链DNA产生一个单链切口的条件下，用DNA酶Ⅰ轻度消化结合因子-DNA复合物。而保护因子所结合的DNA区域，使其免于被DNA酶Ⅰ所消化。结果所得的消化后的DNA酶Ⅰ混合物，用凝胶装置进行电泳。放射自显影后，比较有序列特异性DNA结合因子与无特异性的结合因子产生DNA酶Ⅰ消化梯。与不含结合因子的对照相比，在DNA酶Ⅰ消化梯上DNA片段与因子结合的区域显示一条空白带，即为“足迹”。 凝胶迁移率变动分析技术如下： DNA结合因子先