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Chapter 9 细胞工程 问题：植物远缘杂交困难的原因之一是杂交 不亲和性，即种与种之间存在生殖隔离。 分别如何克服？ ◆克服受精前障碍的最有效方法：离体授精 ◆克服受精后障碍：胚培养 Copyright ? 2012 Song, All rights reserved. 第 9 章 Plant In?Vitro Fertilization??(IVF) 植物离体受精 Chapter 9 细胞工程 ?理论意义：揭示植物受精生理生化机制和早期胚胎发育研究。 §9-1 植物离体受精 1、植物离体受精概念： 指在体外无菌条件下培养未受精的子房、胚珠和花粉，使花粉萌发进入胚珠完成受精的技术。 2、植物离体受精意义： Plant In?Vitro Fertilization??(IVF) Copyright ? 2012 Song, All rights reserved. Chapter 9 细胞工程 Copyright ? 2012 Song, All rights reserved. ?应用意义 ①克服植物远缘杂交（杂种细胞培养困难）或自交不亲和性（柱头与花粉识别障碍），培育新品种； 体细胞杂交远缘植物间常发生：一方亲本排除另一方染色体现象；杂种细胞不分裂、愈伤组织不分化；后代不稳定等。 ②花粉管通道法转基因植株培育。 Chapter 9 细胞工程 §9-2 植物离体传粉 1、子房离体授粉 通过人工授粉方法，使花粉粒不经柱头和花柱直接进入子房中的胚珠，完成受精作用，从而获得远源杂种。 方法: ①直接引入法：在子房壁或顶端切个开口，灌注以花粉悬浮液，完成授精过程。再离体培养。 ②注射法：在子房顶端和基部开2个注射孔，用装有花粉悬浮液的注射器从顶端注射，起到基部孔有流出；用凡士林封闭孔口，再离体培养。 Copyright ? 2012 Song, All rights reserved. Chapter 9 细胞工程 离体胚珠人工授粉： 取出带胚座的胚珠 ?直接在胚珠表面授予无菌花粉，再离体培养； ?将胚珠接种在撒落有花粉（可预培养）的培养基上完成授精。 §9-2 植物离体传粉 2、胚珠试管受精 Copyright ? 2012 Song, All rights reserved. Chapter 9 细胞工程 §9-3 植物体外受精 体外受精必须先获得有活力的精细胞和卵细胞: 1、精细胞的获得方法 ①研磨法：用研钵或玻璃匀桨器研磨破花粉细胞壁，释放出精细胞。 ②渗透压冲击法： 一步法：将花粉细胞置于低渗压溶液中，细胞吸水胀破，释放出精细胞。 二步法：先将花粉细胞置于适宜浓度蔗糖溶液中水合适应一段时间，再用水稀释溶液成低渗液，使细胞胀破而释放出精细胞。 Copyright ? 2012 Song, All rights reserved. Chapter 9 细胞工程 §9-3 植物体外受精 ③活体-离体法： 精细胞的释放：将人工授粉后形成的花粉管连同花柱切下，插入培养液中生长直到精细胞出现，再切取基部用纤维素酶或果胶酶水解细胞壁，或采用低渗法释放出精细胞。 纯化：用20-35目筛孔过滤除去杂质和营养核细胞，再用密度梯度离心法分离出高纯的精细胞。 保存：精细胞保存在含有适当浓度蔗糖、山梨醇糖等维持细胞渗透压的培养基溶液中，并加入PDS/BSA/Ca2+等膜稳定剂中，pH6-7。 Copyright ? 2012 Song, All rights reserved. Chapter 9 细胞工程 §9-3 植物体外受精 2、卵细胞的分离方法（难度较大） ①酶解法：用纤维素酶或果胶酶水解分离出胚囊，继续延长时间，可离散出单个的卵细胞，再用吸管吸出，培养液中保存。 ②酶解-压片法： 酶解胚珠后，再做装片，挤压出卵细胞。 ③酶解-解剖法： 酶解胚珠后，在倒置显微镜下从胚珠解剖出卵细胞。 Copyright ? 2012 Song, All rights reserved. Chapter 9 细胞工程 §9-3 植物体外受精 3、人工合子 采用人工诱导细胞融合方法（PEG法、电融合法）促使精细胞与卵细胞融合，便形成人工合子，再经胚胎发育成植株。 1991年，Klanz用电融合法首次在玉米上取得了精卵细胞体外受精成功，融合率达79%，经看护培养得到了再生植株。 Copyright ? 2012 Song, All rights reserved. Thank?you!