课内生物化学实验指导(内容).docVIP

实验一 血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳 [实验目的] （1）了解电泳的一般原理、撑握醋酸纤维素薄膜电泳操作技术。 （2）测定人血清中各种蛋白质的相对百分含量。 [实验原理] 带电荷的胶体粒子在电场中移动的现象称为电泳。醋酸纤维素薄膜电泳法是以醋酸纤维素薄膜作为支持物。 血清中含多种蛋白质，当在pH这8.6时，这些蛋白质均带负电，它们在电场中向阳极移动，由于各种蛋白质所带负电荷多少及颗粒大少不同，所以在同一电场，同一pH环境中泳动速度不同。 本实验以醋酸纤维素为电泳支持物，分离各种血清蛋白。血清中含有清蛋白，α-球蛋白、β-球蛋白、γ-球蛋白和各种脂蛋白等。各种蛋白质由于氢基酸组分、立体构象、分子量、等电点及形状不同（表17.1），在电场中迁移速度不同。分子量小、等电点低、在相同碱性pH缓冲体系中、带负电荷表2 人血清中12种蛋白质的等电点及分子量 蛋白质名称 等电点（pI） 分 子 量 清蛋白 α-球蛋白 β-球蛋白 γ-球蛋白 4.88 5.06 5.12 6.85-7.50 69000 α1—200000 α2——300000 90000—150000 156000—300000 多的蛋白质颗粒在电场中迁移速度快。例如，以醋酸纤维素薄膜为支持物，正常人血清中pH8.6的缓冲体系中电泳1h左右，染色后可显示5条区带。清蛋白泳动最快，其余依次为α1-，α2-，β-及γ-球蛋白（如图17.1）。这些区带经洗脱后可用分光光度法定量，也可直接进行光吸收扫措自动绘出区带吸收峰及相对百分比。临床医学常利用它们异常区带的出现作为临床鉴别诊断的依据。此法由于操作简单，快速。目前，已成为临床生化检验的常规操作之一 [临床意义] 清蛋白62-72% α1—球蛋白3-4% α2—球蛋白6-10% β- —球蛋白7-11% γ-9-18% 血清蛋白电泳的病理改变多半是清蛋白隆低和一种或二种以上球蛋白增加，其临床意义表3 血清蛋质的临床意义 清蛋白 球蛋白 附 注 α1 α2 β γ 妊 娠 ↓↓ ↑ ↓ 中毒时更明显，产后2-3个月正常 婴 儿 ↑ ↑ ↑ 6个月时γ正常，其它成分6-10岁时正常 多发性骨髓瘤 ↑ ↑ ↑↑ 异常球蛋白，可在β和γ区带间出现M区带 糖尿病 ↓ 肝硬变 ↓↓ ↑ ↑ ↑↑ 在晚期失代偿时 阻塞性黄疸 ↑ 无丙种球蛋白血症 ↓↓ 全身性红斑狼疮 ↓ ↑↑ ↑ 类风湿性关节炎 ↓ ↑ 风湿热 ↑ ↑ 淀粉样变性 ↓↓ ↑↑ 肾病 ↓ ↑↑ ↑ ↓ [试剂] 1.巴比妥缓冲液（pH8.6离子强度为0.06）：称取巴比妥纳12.76克，巴比妥1.66克，置于盛有200ml蒸馏水的烧杯中稍加热溶解后，移置100ml容量瓶中，加蒸馏水稀释至刻度。 2.染色液：氨基黑10B.5克，加甲醇50ml，冰乙酸50ml，蒸馏水40ml，溶后备用。 3.漂洗液：甲醇或乙醇45ml，加冰乙酸5ml，混匀即可。 4.洗脱液：0.4MNaOH 5.透时度：冰乙酸25ml，加95%乙醇75ml混匀。 [操作] 1.准备点样：将薄膜条（8×2cm）浸入巴比妥缓冲液，再于薄膜的无光泽面的一端1.5cm处，用毛细管或玻片取血清呈直线状滴加，等渗入膜内后，将薄膜有样品的一面向下（以防蒸发干）贴在电泳槽架上，两端用浸湿的滤纸作桥贴紧。盖严，平衡5分钟。 2.通电：一般电压为120-140V，电流约（0.4-0.6mA/cm）通电45-60分钟，待电泳区带展开约25-35mm后关闭电源。 3.染色：通电完毕，将薄膜直接浸于染色液中：2-3分钟后取出，用漂洗液清洗数次，脱色至背景为无色。 4.定量：将漂洗净的薄膜干，剪下各个蛋白色带，同时按各区带的平均宽度剪下一条空白区带，然后分别浸入0.4MNaOH5ml的试管中，振摇数次，使色泽浸出。于50-620毫微米波长处比色，以空白带浸出液调整零点，测各部分光密度为：A、α1、α2、β、γ，按下列方法计算： 光密度总和T A+α1+α2+β+γ 各部分蛋白质百分含量为： 清蛋白（%） α1球蛋白（%） α2球蛋白（%） β球蛋白（%） γ球蛋白（%） 5.透明：待薄膜完全干燥后，浸入透时液约5-10分钟，取出平贴在玻璃板上，完全干燥后即成透明的膜，可于光密度计上测定密度，或作标本永远保存。 结果分析： [作业与思考] 根据人血清中血清蛋白各组分等电点，如何估计它们在pH 8.6的巴比妥缓冲液中移动的相对置？实验 ALT测定标准曲线的制作 [实验目的] 了解标准曲线制作的基本过程及使用标准曲线的意义。 [波长及在光电地色中滤光法的选择] λ（nm） 滤光片颜色 测定介质颜色 400~435 435~480 48