课内生物技术综合试验终稿.docVIP

生物技术综合试验 目的：主要是通过本课程的学习，使学生受到严格的基因工程和分子生物学等技术实验技能的训练，熟悉现代生物技术仪器的基本操作使用和应用范围，加深对生物技术系列相关课程基本理论、基本技术原理的理解认识。 实验一、质粒DNA的小量提取 实验二、双酶切反应 实验三、PET28-a质粒载体的胶回收 实验四、引物设计 实验五、目的片段的PCR扩增 实验六、PCR产物的双酶切反应 实验七、PCR产物的胶回收 实验八、目的片段OMP31、BLS与PET28-a载体的连接反应 实验九、大肠杆菌感受态细胞的制备 实验十、重组质粒转化感受态细胞的实验 实验十一、菌落PCR反应 实验十二、IPTG诱导OMP31和BLS融合基因的表达 实验十三、SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 实验一、质粒DNA的小量提取 目的要求 掌握用试剂盒提取质粒DNA的技术 掌握用分光光度计测定DNA浓度的方法 基本原理 在染色体外能自主复制且稳定遗产的遗传因子称为质粒，大小在1kb-200kb之间，是双链闭合环状的DNA分子。在细菌、放线菌、真菌以及一些动植物细胞中都发现有质粒存在，其中细菌质粒存在最为普遍，在基因工程中常用作基因载体。碱变性法又称碱抽提法或碱裂解法，是一种用的最广泛的制备质粒DNA的方法，此法是基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离目的。在pH高达12.6的碱性条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性，质粒DNA的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会分离。当以pH4.8的NaAc高盐缓冲液调节起pH至中性时，变性的质粒DNA又恢复原来的构型，保存在溶液中，而染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构。通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质－SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。 仪器、材料和试剂 1.仪器：微量移液器、微量离心管（又称Eppendorf管）、常用玻璃器皿、台式高速离心机、分光光度计 2.材料：含有质粒的大肠杆菌DH5a 3.试剂及溶液：LB培养基、葡萄糖 质粒小提试剂盒 操作步骤 1．质粒DNA的提取 1）培养细菌：将带有质粒的单菌落，接种到LB液体培养基中，37oC，200r/min,过夜震荡培养； 2）柱平衡步骤：向吸附柱CP3中（吸附柱放入收集管中）加入500ul的平衡液BL,12000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。（请使用当天处理过的柱子） 3）取过夜培养的细菌培养液3mL于Eppendorf管中,转速12000r/min离心1min,去掉上清夜,用滤纸吸干； 4）向留有菌体沉淀的离心管中加入250ul溶液P1（确保已加入RNaseA），用枪头混匀； 5）向离心管中加入250μl溶液P2，温和上下翻转6-8次使菌体充分裂解。 6）向离心管中加入350μl溶液P3，立即温和上下翻转6-8次，充分混匀，此时将出现白色絮状沉淀。12000rpm离心10分钟，此时在离心管底部形成沉淀。 7）将上一步收集的上清液用移液器转移到吸附柱CP3中（吸附柱放入收集管中）尽量不要吸出沉淀。12000rmp离心30-60s,倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3放入收集管中。 8）向吸附柱CP3中加入600ul漂洗液PW(加入无水乙醇)，12000rmp离心30-60s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3放入收集管中。 9）重复步骤8。 10）将吸附柱CP3放入收集管中，，12000rmp离心2分钟，目的是将吸附柱中的残留的漂洗液去除。 11）将吸附柱CP3置于一个干净的离心管中，向吸附膜中间部位滴加50-100ul洗脱缓冲液EB，温室放置2分钟，12000rmp离心2分钟将质粒溶液收集到离心管中。 2．用分光光度计测定质粒DNA的浓度 五、问题讨论 (1)提取质粒DNA有多种方法，所有这些方法都包括3个基本步骤：培养细胞使质粒扩增；收集和裂解细菌；分离和纯化质粒DNA。可采用溶菌酶破坏菌体细胞壁，SDS（十二烷基硫酸钠）可使细胞壁裂解。经溶菌酶和SDS处理后，在碱性条件下细菌染色体DNA和质粒DNA都变性，而当加入乙酸钾在中性条件下，巨大的染色体DNA分子难以复性，而质粒DNA很快得以复性，离心时染色体DNA与细胞碎片一起被沉淀下来，而质粒DNA则留在上清夜中，用异丙醇或乙醇沉淀后洗涤，可得到质粒DNA。 (2)利用核酸的紫外吸收测定核酸浓度的光学定量法，是定量DNA、RNA常用且快速的方法。组成核酸的五种碱基（G，A，T，C，U）均在260nm处有强吸收峰，正是利用这一强吸收峰而对核酸进行定量的。碱基的种类不同，最大吸收波长以及吸光系数不同，即使是相同碱基，也会随pH的变化，吸光系数也会产生变化，一般在中性