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生物工程综合大实验 木聚糖是存在于植物细胞壁中最丰富的半纤维素，其化学结构较纤维素复杂得多，它是一个以β-1,4-糖苷键相连的木聚糖主链上带着一些不同的取代基如乙酰基、阿拉伯糖基、4-O-甲基葡萄糖醛酸和阿魏酸残基等而构成的。Endo-β-1,4-木聚糖内切酶EC 3.2.1.8）简称木聚糖酶，是木聚糖降解过程中最关键的一个酶，也是被研究最多的一个半纤维素酶，随机水解木聚糖主干链内部的β-1,4-糖苷键，产生木寡糖、木二糖和少量木糖。在造纸工业饲料工业食品工业低聚木糖木聚糖酶活性的测定是以0.5%燕麦木聚糖为底物，利用对羟基苯甲酸酰肼与水解反应产生的还原糖nm的光吸收值的大小计算酶活。 用分光光度法测定木聚糖水解产物还原糖的含量，先要制作标准曲线，然后根据标准曲线查出还原糖的含量，最后根据产物的含量就可以计算出酶的活性。因此，制作标准曲线是酶活性测定的一项基本技术。 Bradford法是基于考马斯亮蓝G-250有红、蓝两种不同颜色的形式，在一定浓度的乙醇和酸性条件下，可配成淡红色的溶液，当与蛋白质结合后，产生蓝色化合物，反应迅速稳定，反应化合物在465～595nm有最大的吸光值，化合物颜色的深浅与蛋白质浓度的高低成正比关系。因此可检测595nm的光吸收值的大小计算蛋白质的含量。 同样，测定某一种蛋白质的浓度时，也要先用已知浓度的一种蛋白质制作标准曲线，然后根据标准曲线查出待测蛋白质的浓度。 3、试剂 ①标准木糖溶液： 准确称取经105℃烘至恒重的无水木糖1g,用蒸馏水定容至100ml(即1%)，实际应用时稀释到0.01% ②邻苯二甲酸氢钾缓冲液： 准确配制0.1 M pH5.8 (90℃) 的缓冲液终止剂/显色剂PAHBAH0.5 M HCl溶解的5%（w/v）对羟基苯甲酸酰肼（p-hydroxybenzoic acid）200 ml，配好后储藏于4℃冰箱 B: 0.5 M NaOH 1 L 使用时，将A与B按1：4的体积比混合即为PAHBAH显色剂 ④Bradford 储存液： 100 ml 95%乙醇，200 ml 85%磷酸，350mg 考马斯亮蓝G-250 可在室温下长期保持稳定 ⑤Bradford 工作液： 425 ml双蒸水，15 ml 95%乙醇，30 ml 85%磷酸，30 ml Bradford 储存液 滤纸过滤后保存于室温棕色瓶中 ⑥标准蛋白质溶液: 以牛血清白蛋白(BSA )作为标准蛋白，配制成1 mg/ml 标准溶液，用时可稀释。 4、器材 分光光度计、、电子天平、水浴锅、煮沸电炉、移液管、泡沫浮子若干、pH计、磁力搅拌器冰水 5、实验步骤： A. 木糖标准曲线的制作 木聚糖酶活性的测定是以0.5% 燕麦木聚糖为底物，利用对羟基苯甲酸酰肼与水解反应产生的还原糖的显色反应进行比色，具体方法是μl，添加μl酶液μl 0.5%（w/v）燕麦木聚糖μl 100 mM pH 5.8的缓冲液，最后加入终止剂/显色剂PAHBAH终止反应。其混合物在沸水浴中加热10 min后，在冰水浴中冷却，用分光光度计在410 nm下测其吸收值。木聚糖酶活性单位定义为每分钟催化产生1 μmo木糖的酶量。3 mL100 mM pH 5.8的缓冲液mL 木糖溶液+(0.3-x) mL 无菌水）+ 1.8 mL终止剂/显色剂PAHBAH其混合物在沸水浴中加热10 min后，在冰水浴中冷却，用分光光度计在410 nm下测其吸收值。 pH 5.8的缓冲液1%）、无菌水三者混合均匀，保证整个体系的总体积为600 μl，通过控制加入木糖溶液的体积量来调整混合液中木糖的量。每次得到的600μl混合液与1.8 mL的PAHBAH试剂混匀后，在沸水浴中加热10 min后在冰水浴中冷却，用分光光度计在410 nm下600μl混合液里不含标准木糖溶液的为空白对照。 0.01%木糖（μl） 30 50 80 100 120 150 180 200 H2O(μl) 270 250 220 200 180 150 120 100 缓冲液(μl) 300 300 300 300 300 300 250 200 PAHBAH(mL) 1.8 1.8 1.8 1.8 1.8 1.8 1.8 1.8 A410 A410平均值 ② 以A410为纵坐标，木糖的量（?mol）为横坐标（尽量选取吸光度在0.1～0.8之间的点），在Excel上绘制标准曲线，经线性回归后得到A410-木糖?mol)的标准曲线 x + b, x为木糖 (?mol)R2值应在0.99以上，至少小数点后两个9。 B．Bradford法测定蛋白质浓度标准曲线的制作 ① 按下表将标准蛋白质溶液小牛