实验十 pUC5 T载体的制备.docVIP

实验十 pUC57 T载体的制备 一．原理 PCR产物的克隆是一种有效的克隆目的基因的方法，但是在实际应用中，由于方法学上 的一些技术问题可能限制其应用。由于PCR产物3`末端突出一个A，因此克隆PCR产物的 载体3`末端必须突出一个T，这样载体与PCR产物之间形成粘性长端。现在许多公司开发 出了此类专用于PCR产物克隆的T载体。本实验中将平端内切酶EcoRv酶解的EcoRv，用 Taq酶将其3`末端加上T，然后用T4连接酶将能自身环化的质粒连接。用凝胶电泳将自身 环化的质粒与3`末端带有T．不能自身环化的线性质粒分开，回收线性质粒片段即为pUC57 T载体。 二．方法 1．制备pUC57质粒DNA。(见实验一) 2．用EcoR V酶解pUC57 DNA。(见实验九) 3．在酶解的pUC57 DNA末端加上T。 取一支0.5ml微离心管．加入： EcoR V酶解的pUC57 DNA 10μg 10 X PCR缓冲液 15μl dTTP 10mmol／L 20μl Taq DNA聚合酶(5U/μl) 1μl ddH2O to 150μl 10 000r/min离心5s混匀，72℃水浴2h。 4.DNA片段的纯化 (1)在上述0