工程菌生产的蛋白涵体的复性与纯化-秦.docVIP

第八章 工程菌生产的蛋白包涵体的复性与纯化 分子生物学的发展使蛋白质的表达和生产进入到一个新的时代。大肠杆菌由于遗传背景清晰，容易培养，可以大规模发酵，以及大量可供选择利用的克隆和高效表达载体而成为目前人们克隆和表达外源基因的首选菌株。但是，在实际操作中重组蛋白质在大肠杆菌中的高水平表达往往导致蛋白质聚集形成不溶性的包涵体。包涵体的形成虽有不少优点，如可溶性形式存在的外源蛋白在细胞内容易受到蛋白酶的攻击，而包涵体形式存在的外源蛋白则不易被蛋白酶降解；包涵体的形成降低了细胞内外源蛋白的浓度，有利于表达量的提高；包涵体中杂蛋白含量较低，且只需要简单的低速离心就可以与可溶性蛋白分离，有利于分离纯化；包涵体对机械搅拌和超声破碎不敏感，易于破壁，并与细胞膜碎片分离等。但是，无活性的包涵体蛋白质需经过复性使其折叠成为具有天然构象和生物活性的蛋白质，这通常是一件很困难的事情，而且不同的蛋白质其复性方法也各不相同，因此基因重组蛋白质的复性一直是生物工程下游纯化技术的研究热点之一。现有的生物技术研究和产业化过程表明，重组蛋白包涵体的变性及复性是重组蛋白类药物生产中最为关键的技术之一，是基因工程产品商业化的瓶颈，也是一个世界性难题。 第一节 包涵体形成的原因 １．什么是包涵体 　　 所谓包涵体是指由于表达部位低电势及外源蛋白质分子的特殊结构（如Cys含量高），如低电荷，无糖基化等，使得重组蛋白质与核酸，周围杂蛋白质（如核糖体元件、RNA聚合酶、内毒素、外膜蛋白质ompC、ompF和ompA等），以及脂体、脂多糖等形成的聚合体(图8-1)。包涵体一般大小为0.1~3.0 μm，具有很高的密度（约1.3 mg/ml），无定形，呈非水溶性，只溶于尿素、盐酸胍等变性剂。包涵体中重组蛋白质一般占包涵体总成分的50%以上，它们没有生物学活性，因为蛋白质分子没有形成正确的构象。有报道表明成熟的分子相比包涵体内蛋白质含有更多的β结构而较少的?结构，也有报道表明包涵体中的肽链已获得与天然蛋白质分子非常接近的空间构象。 图8-1 在大肠杆菌中表达的包涵体（来源于Dr. Hauke LiLie) ２．形成包涵体的原因 包涵体形成的原因是多方面的，归纳起来大致有以下几方面： （1）基因工程菌的表达产率过高，超过了细菌正常的代谢水平：研究发现在蛋白质低表达时很少形成包涵体，表达量越高越容易形成包涵体。原因可能是蛋白质合成的速度太快，多肽链相互缠绕，缺乏使多肽链正确折叠的因素，二硫键不能正确的配对，疏水基团外露等。一般当表达的目的蛋白质量超过细菌总蛋白质量的10%时，就很容易形成包涵体。 （2）重组蛋白质的氨基酸组成：一般而言含硫的氨基酸越多越易形成包涵体，而脯氨酸的含量也明显与包涵体的形成呈正相关。 （3） 宿主菌及其培养条件：较高的发酵温度容易导致包涵体的形成，而降低宿主菌的培养温度被证明对增加重组蛋白的可溶性表达是有效的。主要原因可能是降低温度可以增加折叠中间体的稳定性或减少折叠中间体之间错误的相互作用，特别是疏水作用。丰富的培养基被认为有利于活性蛋白质的表达，当培养条件不佳时，也容易导致包涵体的形成。此外选择合适的宿主菌，改变培养基的pH等方法有时也能增加重组蛋白质的可溶性表达。 （4）重组蛋白质缺乏翻译后修饰：由于大肠杆菌表达系统属于原核表达系统，缺少真核细胞中翻译后修饰所需酶类和辅助因子，如折叠酶和分子伴侣等，故致使中间体大量积累，容易形成包涵体沉淀。 （5）蛋白质在合成之后，于中性pH或接近中性pH的环境下，其本身固有的溶解度对于包涵体的形成比较关键。这其实与蛋白质本身的性质有关，如果蛋白质合成后，其本身的溶解度比较高，就不容易形成包涵体。 （6）在细菌分泌的某个阶段，蛋白质分子间的离子键、疏水键或共价键等化学作用导致了包涵体的形成。 第二节 包涵体的制备和溶解 基因工程发酵液经离心浓缩后，可用机械磨碎法、超声波处理法或溶菌酶加去污剂的方法使细菌裂解，裂菌程度可通过取样镜检来确定。裂菌完成后离心收集沉淀即为包涵体，离心分离包涵体时的离心力不宜过大，离心时间不宜过长，以电泳检测上清中基本不含重组蛋白质即可，这样可以减少沉淀中菌体细胞膜碎片、核糖体等的含量从而提高粗制包涵体的纯度。包涵体分离方法的选择与所表达蛋白质的性质没有明显关系。 为了去除粗制包涵体上粘附的杂质，如膜蛋白或核酸，可应用洗涤液洗涤包涵体。洗涤液通常选用去污剂Triton X-100、脱氧胆酸钠、蔗糖、尿素、盐酸胍等配制。但必须注意过高浓度的尿素或盐酸胍会使包涵体溶解。经洗涤后的包涵体的纯度一般可达到80%左右。 洗涤、纯化后的包涵体必须用含变性剂的溶液使之溶解。溶解的过程一般应包括包涵体蛋白质的变性和错配二硫键的还原。包涵体蛋白质变性常用的变性剂有4~7mol/L的盐酸胍，6