人胰岛素原在大肠杆菌的表达.docVIP

人胰岛素原在大肠杆菌的表达 组员：林秀秀 吴晓晖 季健夫 洪非凡 研究背景 目前全世界约有6000万人患糖尿病。糖尿病的病因是胰脏的胰岛细胞不能分泌足量的胰岛素，从而使患者的血糖过高。糖尿病患者的死亡率仅次于癌症和心脏病。 胰岛素能降低人体内血糖的含量，从1921年到目前为止，医学上一直采用胰岛素治疗糖尿病。但胰岛素来源十分困难，以往主要靠从牛、猪等大牲畜的胰腺中提取。一头牛或一头猪的胰脏只能产生300个单位或30ml的胰岛素，而一个病人每天则需要40个单位或４ml的胰岛素，显然胰岛素产量远远不能满足病人的需要。 基因工程技术的问世为解决这个问题提供了一条崭新的途径——通过基因工程改造工程菌大规模生产人胰岛素。利用基因工程技术将人胰岛素原基因导入到大肠杆菌中，通过诱导表达能生产大量的人胰岛素原，纯化后经人为加工可以得到人胰岛素蛋白。 1、目的基因的合成 参考人胰岛素原基因的序列设计并合成引物,以人基因组基因作为模板用，PCR试剂盒扩增 上游引物Ⅰ : 5-AGT GCC CTG TGG ATG CGC CTC-3 下游引物Ⅱ : 5-CTA GTT GCA GTA GTT CTC CAG ATG-3 （可供参考的引物序列） PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳进行检测鉴定 重组质粒构建 4μL PCR产物（目的基因） 1μL 表达载体（pGAPZa） 0.8μL T4DNA连接酶（200U/μL） 1μL 连接酶缓冲液 10×buffer 3.2μ灭菌去离子水 震荡，短暂离心，4℃过夜 3、感受态细胞的制备 （1）?在超净工作台中，将1ml大肠杆菌菌液加入100ml LB液态培养基（不含抗菌素），37℃摇床培养过夜。 （2）?取0.5ml上述菌液转接到含有50mL LB培养基的三角烧瓶中，37℃下250r/min摇床培养2-3h　　 （3）?将1ml菌液加入到4支1.5mL预冷无菌的聚丙烯离心管中，于冰上放置10min，然后于4℃，5000rpm离心5min。 （4）?将离心管倒置以倒尽上清液，加入1ml?冰冷的0.1 mol/L CaCl2溶液，立即在涡旋混合器上混匀，插入冰中放置20min。 （5） 4℃，5000rpm离心5min，弃上清液后，用100μL?冰冷的0.1 mol/L CaCl2溶液垂悬，插入冰中放置1h，可以直接用作转化实验 （6）?事先将恒温水浴的温度调到42℃。 （7）?加入5μL连接好的质粒混合液（DNA含量不超过100ng），轻轻震荡后放置冰上20min。 （8）?轻轻摇匀后插入42℃水浴中90s进行热休克，然后迅速放回冰中，静置3min。 （9）?在超净工作台中向上述各管中分别加入300μL LB培养基（不含抗菌素）轻轻混匀，然后固定到摇床的弹簧架上37℃震荡30min。 （10）?在超净工作台中取上述转化混合液200μL，分别滴到含合适抗菌素（Amp 100ug/L）的固体LB平板培养皿中，再在平板上滴加40μL 20mg/ml X-gal，7μL 200mg/ml IPTG，用酒精灯烧过的玻璃涂布棒涂布均匀 （11）?在涂好的培养皿上做上标记，先放置在37℃恒温培养箱中30min直到表面的液体都渗透到培养基里后，再倒置过来放入37℃恒温培养箱过夜。 （12）?观察平板上长出的菌落克隆，以菌落之间能互相分开为好。注意白色菌斑。 4、重组质粒的鉴定 无菌条件下，挑取 Amp+抗性平板上的阳性菌落于 5 mL 含有 25 μg/mL Amp+抗性的LB 液体培养基37℃、180r/min 振荡培养 8h，试剂盒抽提重组质粒。将提取的重组质粒经过 EcoRI和 Nru I进行鉴定 5、重组蛋白的诱导表达 无菌条件下，分别挑取单个菌落接种于 5 mL含Amp+ 终浓度 100 μg/mL 抗性的 LB液体培养基中，37 ℃、180 r/min 培养；待菌液微浑，分别将 5 mL 的菌液对接入 50mL含Amp+抗性的 LB 液体培养基中，37 ℃、180 r/min 培养；当 OD600值约为0.4-0.7之间时加入 50μl的1MIPTG，37℃、200r/min诱导4 h. 6、重组蛋白的提取 超声波破碎细胞，12000rpm离心，保留上清，经过凝胶色谱柱进一步纯化 7、鉴定（westen blot法） 经SDS电泳,取样，电转移至 PVDF 膜上，加入含 5%脱脂牛奶的 TBST 室温封闭 1 h；用 TBSTbuffer 洗涤3次，加入小鼠抗胰岛素单克隆抗体（1：500稀释），4℃孵育过夜；用TBST buffer 洗涤3次，加入HRP标记的羊抗小鼠 IgG（1：1000 稀释），37 ℃孵育1h；用 TBST buffer洗涤后加入DAB显色。