大肠杆菌质粒转染实验-QIAGEN大提试剂盒.docVIP

质粒抽提 一、溶液及培养基配制： 1、LB液体培养基 （1）配方： 酵母提取物 Yeast extract 5g/L 胰蛋白胨 Tryptone 10g/L （2）配制： A、称量：称取培养基各成分所需量，置于烧杯中。 B、溶化：加入所需水量2/3的蒸馏水于中，搅拌使药品全部溶化。 、定容。 、加塞、包扎。 、高压灭菌121℃，0min，灭菌后室温保存备用。2、LB固体培养基 （1）配方： 酵母提取物 Yeast extract 5g/L 氯化钠 NaCl 5g/L 胰蛋白胨 Tryptone 10g/L 氨苄青霉素溶液 100μg/ml（终浓度） 琼脂粉 15g/L （2）配制： A、称量：称取培养基各成分所需量，置于烧杯中。 B、溶化：加入所需水量2/3的蒸馏水于烧杯中，搅拌使药品全部溶化。 C、5mol/L NaOH溶液调pH到7.4。 D、定容。 、分装、加塞、包扎。 、高压灭菌121℃，30min。 、灭菌后，将融化的LB固体培养基置与55℃的水浴中（或室温），待培养基温度降到55℃时（手可触摸）加入抗生素，（免温度过高导致抗生素失效），并充分摇匀。 （3）倒板：一般0ml倒1块板培养基倒入培养皿后，打开盖子，℃保存备用，使用前提前拿出，防止水蒸气滴入板中。 首要检查是否有足够的固体和液体LB培养基，基本上每个质粒需要一块固体培养基，小摇的2ml和大摇的250ml LB培养基。小摇的可以在一个50ml离心管中预备着，每次直接取用。转化所需L形玻璃棒需确认已灭菌 摇菌器申请，张评浒老师，王雪师姐； 注意：考虑到多种东西需要灭菌，可以在转化之前或者小摇大摇那天一起灭菌。所有需要提前灭菌的东西有：足量液体LB培养基灭菌后加入AMP；蓝黄白枪头至少个一盒，备用；1.5ml doff管；Beckman离心机专用离心管；锡箔纸；250ml锥形瓶，500或者1000ml锥形瓶；电动移液器所用移液管（可以考虑用5ml移液枪，则先灭菌5ml枪头）；超纯水和TE buffer Step1：转化: 事前准备的： 提前将固体培养基至于超净台中，使之回复室温； 灭过菌的L形玻棒，确认微生物室有灭过菌的； 灭过菌烘干的进口1.5ml doff管足量； 100μL枪及灭菌黄枪头（微生物室或许有），10μL枪及灭菌白枪头； Marker笔 烧杯，温度计 小冰盒以及冰 注意感受态融化需要时间，可以先将感受态取出融化的时间内做其他准备工作 感受态提前半小时从-80冰箱取出插到冰里融化，半融化即可（冰内30min即可）。 将冰箱里的固体培养基，灭过菌烘干的进口1.5ml doff管，灭过菌的L形玻棒，枪及枪头取出备用。 感受态融化后将其分装，50μl/管（注意在加质粒前在各个管子上标注好要加入的质粒名称以防混淆）。 每个管加3μl质粒，轻轻吹打均匀，冰上静置30min 。 42℃水浴放置90秒后迅速拿出，插到冰里。 铺板，每个质粒铺5μl/板。放置过夜。 所有操作尽量在超净台内完成，避免杂菌污染。 Step2：小摇及大摇 事先准备： 灭过菌的加过AMP的LB液体培养基，每个质粒至少250ml左右； 15ml离心管； 灭过菌的250ml及500ml或1000ml锥形瓶 灭过菌的白枪头及枪；灭过菌的蓝枪头及枪； marker笔，医用胶带，封口膜，垃圾袋 灭过菌的锡箔纸 申请Beckman离心机，借Beckman离心机专用离心管，为第二天抽提做准备 1、观察菌落生长状况，若无异常，准备小摇。 2、准备LB液体培养基（灭菌，AMP），分装至50ml离心管中（注明使用与否、加氨苄量、配制时间等），可在4度冰箱内储备使用；将15ml离心管上按待扩增质粒名称做好标记。 3、从分装的50ml离心管中，向15ml离心管中加入2ml液体LB（灭菌，AMP）培养基（注意尽量不要留在瓶壁上）。多余培养基使用后封口，4度保存。 4、以孤立的菌落点为目标，用枪头（推荐白枪头）刮取微量菌落，溶于2ml培养基中。将离心管盖子拧松后用胶带固定 5、小摇，时间以具体情况定。一般从上午10点左右开始小摇，到当天下午5点可以准备大摇。 6、封好固体培养基，放回4度冰箱，收拾好微生物室台面，清理废液缸及垃圾桶（为了以后能顺利申请到） 7、小摇成功后，液体LB（灭菌，AMP）培养基，每250ml分装于500ml或1000ml锥形瓶中（瓶越大，培养基震荡越充分），不需严格定量。将小摇完成的培养基加入大锥形瓶中（注意在瓶上做好相关标记），灭菌过的锡箔纸包裹瓶口，大摇，过夜。 Step3：质粒抽提（大提，若为中提或小提具体看说明书）（使用进口器材） 注意及时申请Beckman离心机，除了20000g转速必需，其余6000g转速可以用张评浒老师德尔Sigema离心机代替； 准备好试剂盒，检查试剂盒中各