测酶活方法.docVIP

1. POD活性测定：称取组织1g放于研钵中，加5 ml 0.05mol/L的磷酸缓冲液（pH5.5）在冰浴中研磨成匀浆。将匀浆全部转入离心管中，在3000rpm，4℃条件下离心10min，上清液为酶粗提液，4℃保存备用。 取酶液100μL，加反应混合液 1. 2.9ml 0.05mol/L的磷酸缓冲液 pH5.5 2. 1 ml 0.05mol/L愈创木酚溶液， 0.05mol/L愈创木酚溶液,0.06207g愈创木酚定容10ml 3. 1.0 ml 2%H2O2, 30% H2O2670μL，加水至10ml. 在37℃水浴中混合均匀，于470nm处测定其吸光度，连续记录3min。以不加酶的反应混合液作对照，每30秒钟读一次数，以每分钟吸光度值变化值0.01为一个酶活单位。 酶活计算: OD290。g- 1.FW.h- 1 OD变化值/材料鲜重/反应时间 2. CAT活性测定： 设置两个重复一个对照,测定体系包括 1. 0.2 ml酶液、 2. 1.5 ml磷酸缓冲液pH7.0、 3. 1 ml蒸馏水， 4. 25℃预热后逐管加入300μL 0.1 mol/L的H2O2 在240 nm下测定吸光度，每隔1 min读一次，共测3 min，以1 min内减少0.1的酶量为1个酶活单位。 0.1 mol/L的H2O2：30% H2O256.8μL加水至10ml. 3. SOD活性的测定：采用改进的高灵敏度的氯化硝基氮兰四唑（NBT）光还原法测定SOD活性。每处理取3个小烧杯，分别加入3mLSOD反应液（参照附录B）， A）0.lmol/L pH7.8磷酸缓冲液 准确称取0.72gNa2HPO4·12H2O溶于20ml水中取18.3mL；准确称取0.312gNaH2PO4·2H2O溶于20mL水中取1.7mL，混合并定容至20mL。 （B）104mmol/L的甲硫氨酸 称取0.39g甲硫氨酸溶解并定容至25mL。 （C）0.3mmol/L的NBT 称取0.0025g氯化硝基氮兰四唑（NBT），溶解后定容于10mL。 （D）0.8mmol/L的乙二胺四乙酸（EDTA） 准确称取0.01gEDTA，定容于25mL。 （E）50μmol/L的核黄素 称取0.0012g核黄素，定容于10mL容量瓶中。 取A液8mL、B液2mL、C液 4mL、D液2mL，共16mL混匀为SOD反应液。 再加入150μL的50μmol/L的核黄素和150μL粗酶液，在25℃，4000Lx光照20min后于黑暗中停止反应。另作一组不加酶液其它处理同前的作为空白对照，并以pH7.8磷酸缓冲液调零。 在560nm下测定吸光度。计算公式：SOD的OD560值/g鲜重 （对照OD560-样品OD560）/0.5×60 分别计算不同酶液量的各反应系统中抑制NBT光还原的相对百分比,作出二者相关曲线,找出抑制NBT 50%光化学还原的酶液量 μl ,定为一个酶活单位U,计算总酶活单位和酶的比活性。 ④MDA含量测定：取④中粗酶液1.5mL，加入2.5mL0.5%的硫代巴比妥酸（TBA，取0.5gTBA溶解于100mL20%三氯乙酸），在沸水浴中保温30min后，立即冷却，10000rpm离心20min，取上清液分别在450nm、532nm和600nm下测吸光度值（A），计算公式：MDA（μmol/L） 6.45（A532-A600）-0.56A450。 ④PPO活性的测定：植物组织1g，用预冷的P7.8 0.05M 磷酸缓冲液1ml，研磨，再加1ml缓冲液，倾入5ml离心管，于4度，10000rpm下离心20min，收集上清。反应体系为3ml0.2M邻苯二酚（用pH7.8磷酸缓冲液配制），1ml酶液，以灭活的酶液为空白对照，30度下水浴10min，立即用20%三氯乙酸中止反应。离心5000rpm10min，于495nm处测定其吸光值。 pH 8.8硼酸缓冲液 含15 mmol/L巯基乙醇 和50 mg PVP，反应液为：1.6 mL 0.1 mol/L-1硼酸缓冲液 pH8.8，内含10 mmol?L-1苯丙氨酸 加0.2 mL酶液, 37℃反应后,测290nm处的吸光值,以反应时间零作参比。A290变化0.01为一个酶活单位 U?h-1?g-1?mf 。活性 （OD值/0.01t）乘稀释倍数