表面展示技术重点分析.doc

枯草芽胞杆菌( Bacillus subtilis) 是一种典型的好氧型的革兰氏阳性细菌，也是研究的最早且最深入的一种芽胞杆菌。其中枯草芽胞杆菌 168是最早发现的可作为转化的芽胞杆菌菌株，随后对其遗传转化和表达系统做了深入的研究。1997年，日本和欧洲的几个实验室联合完成了枯草芽胞杆菌168 基因组的测序［1］。枯草芽胞杆菌有两个生长时期: 孢子休眠期和生殖生长期。在营养缺乏等胁迫的环境下，枯草芽胞杆菌进入休眠期形成具有抗逆作用的芽胞，在营养充足的环境下，芽胞又会进入生殖时期，即芽胞萌发重新生长成为枯草芽胞杆菌。芽胞抗逆性非常强，在高温和酸碱等极端环境下亦能生存，由于其独特的生理特性，使之成为新型的蛋白质或酶类药物表达载体而倍受关注。由于枯草芽胞杆菌是一种非致病性的益生菌，因此其可以作为一种生物安全的展示外源蛋白的宿主。目前利用该菌株已成功表达了破伤风毒素［2 ～4］、不耐热肠毒素［4］、乙醛酸脱氢 芽孢杆菌属和梭菌属在受到外界应力时如营养缺乏情况下自身母细胞会形成一种休眠体即芽孢,它可以抵御外界环境因素的攻击。年前发现炭疽芽孢杆菌的芽孢即使将其置于沸水中蒸煮一断时间后,它仍能存活下来,这一有趣的现象吸引了科学家们开始探究芽孢的耐热和抵御其他外界环境因素攻击的作用机制。()枯草芽孢杆菌芽孢芽孢杆菌属()在饥饿或环境恶劣等逆环境下,为了抵御外界不良应力这时它的营养细胞会形成一种近椭圆形的休眠体结构即芽孢。芽孢的结构由内到外依次是核心、皮层、芽孢衣壳和芽孢外壁。芽孢的核心一般含有大量的染色体、酶和,但含水量却很低,主要是由于它内部的大部分水分子都被吡啶二羧酸复合体取代掉了。芽孢的外壁由肽聚糖构成,与营养细胞的肽聚糖组分很类似,仅在于含量上有差别。芽孢的衣壳由至少种以上的蛋白构成,这些蛋白也被称为芽孢衣壳蛋白,它们具有抗酶解和抗药物的功能,主要受一系列调控基因和结构基因控制。芽孢的外壁从结构上又可细分为基底层、内层、外层和层四个部分(图)。 芽孢诱导产生的整个过程大概需要将近八个小时。芽孢的形成受一系列调节酶如激酶和磷酸酶、细胞周期及其他机制调控 芽孢形成的步骤可简单地描述成如下几个过程:第一步,包括、和在内的组氨酸感受激酶开始活化,这时组氨酸感受激酶以扩展磷转移的方式运载磷,并促使转录因子发生磷酸化。实际上,诱发芽孢产生的调控过程很简单,因为只需要调控上游的表达就可以实现,并且都不需要考虑它的营养是否缺乏。磷酸化调控的调节子基因很多,包括参与不均等分裂的相关蛋白和参与芽孢形成的σ因子蛋白。不均等分裂会使营养细胞分化成个间隔区,大的是母细胞,而小的则是前孢子。前孢子最终演化为成熟的芽孢。随后,母细胞以一种类似吞噬作用的方式逐渐包裹前孢子。待吞噬完成后,被母细胞吞并的前孢子则被覆盖上了一个双分子层膜。与此同时,还产生了两个外部的保护结构:一个是前孢子内膜与外膜间肽聚糖组装成的核质;另一个是由衣壳蛋白质构成的芽孢最外保护层。实际上,肽聚糖的前体起初是在母细胞中合成的,然后它翻转穿过前孢子外膜进入外膜与内膜间的空间,但是这种翻转机制目前仍不太清楚。最后,母细胞破裂释放成熟的芽孢进入环境中。此时的芽孢能够快速发芽并可通过吸收营养恢复它的增殖能力。 新近发展起来的芽孢表面展示技术,由于其具有独特的稳定性和安全性高的特点而引起广大学者的关注。一般来说,芽孢表面这些系统主要由宿主菌、分子载体和靶蛋白组成。 目前,芽孢表面展示系统中所用的宿主菌有枯草芽孢杆菌、炭疽芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、球形芽孢杆菌和巨大芽孢杆菌。分子载体一般应具有如下特质:①它必须含有一个结构域可以与靶蛋白进行融合;②必须含有一个锚定结构域可使融合蛋白固定在芽孢的表面;③分子载体和靶蛋白可以形成融合蛋白,相互功能不受影响;④还必须具有抗酶解的能力;⑤分子载体的敲除不影响芽孢的正常发芽、成熟和分化。芽孢表面展示系统中的外源蛋白也叫靶蛋白。针对靶蛋白而言,一般并无特别要求,选择的对象应从实验需要出发。 相对于芽孢表面展示系统来说,噬菌体或细菌表面展示系统都存在着一个明显的缺陷,那就是这些系统中形成的融合蛋白都必须至少要穿过细胞质膜才能锚定在宿主的表面,这容易导致有些融合蛋白由于无法穿过细胞质膜进而就不能有效定位在噬菌体或细菌的表面。例如那些细胞周质中快速折叠的蛋白或疏水部位深埋在细胞膜的蛋白往往都不能有效地穿过细胞质膜。芽孢表面展示技术发展较晚,但其却具有如下诸多优点:①芽孢结构比较特殊没有细胞膜结构,所以当它与外源蛋白融合后形成的融合蛋白在固定到芽孢表面的过程中避免了折叠不正确和定位不准确的问题;②其次,由于芽孢具有抗可逆环境等特性,因而它还会提高融合蛋白的稳定性如热稳定性、耐有机溶剂等,尤其在制备生物催化剂方面;③最后,被展示的外源蛋白或多肽范围分布较广,它还可展示多聚体类的