VEGF-B基因靶向siRNA对人肝癌细胞HepG2细胞裸鼠皮下种植瘤的影响资料.ppt

细胞培养试剂 DMEM培养基 GIBCO公司 胎牛血清 FCS 杭州四季青公司 胰蛋白酶 trypsin 美国Sigma公司 PBS液 参照《细胞培养》 二甲基亚砜 DMSO 天津市化学试剂厂 RNA提取和RT-PCR试剂 dNTP Invitrogen公司 M-MLV Invitrogen公司 Oligo Invitrogen公司 5×第一链合成缓冲液 Invitrogen公司 溴酚兰 Invitrogen公司 β-actin引物 Invitrogen公司 VEGF-B引物 Invitrogen公司 TRIquick试剂 Solarbio公司 氯仿 北京化学试剂厂 异丙醇 北京化学试剂厂 乙醇 北京化学试剂厂 焦碳酸乙二酯 DEPC 美国Amresco公司 琼脂糖 美国promega公司 DNA Maker 1100 美国promega公司 琼脂糖 美国promega公司 溴化乙锭 EB sigma公司 电子分析天平JA 5003型 移液器 涡旋混匀器XH-B型 电泳仪DYY-6C型 电泳槽DYCZ-38B型 倒置荧光显微镜TE2000-U型 电热恒温干燥箱 恒温水浴箱HXS-H型 裸鼠饲养笼 美国克罗多拉州生产 RNAi模式图 唐瑞峰等研究发现VEGF-B蛋白在肝癌组织中阳性表达率最高，而在癌旁组织、正常肝组织中阳性表达率呈逐渐下降趋势；VEGF-B受体Flt-1的表达率与VEGF-B成正相关 VEGF-B可能在肝细胞癌的发生发展过程中是一个关键的作用靶点 为此，我们引入世界上较为先进siRNA技术，通过构建VEGF-B基因的siRNA载体质粒，转染至肝癌细胞中，导致VEGF-B的RNA干扰（RNAi）效应 siRNA技术 一种新的基因阻断技术，能够高效、简单的阻断某一特定基因的表达，它不仅是研究基因功能的有力工具，而且为特异性基因治疗提供了新的技术手段 具体干扰机制分为：起始阶段和效应阶段 在起始阶段，Dicer酶与双链RNA特异性结合，双链RNA被切割成21~23nt长度的小干扰RNA 在效应阶段，siRNA与核酶复合体参与合成RNA诱导的沉默复合体 RNA-induced silencing complex, RISC 并被激活，激活的RISC在胞浆解旋双链siRNA，RISC内部核酸内切酶负责催化其内部的单链siRNA去识别与之互补的mRNA链，并对其进行切割，最终在核酸外切酶的作用下降解切断后的mRNA，从而阻止靶基因的表达。 VEGF-B基因靶向siRNA对人肝癌细胞HepG2细胞裸鼠皮下种植瘤的影响 导 师 唐瑞峰 教授 研究生 吴剑飞 河北医科大学第四医院肝胆外科 前 言 原发性肝癌与VEGF-B 最常见的恶性肿瘤之一，发病率升高，恶性程度高，进展迅速，易侵袭、转移、复发。 肿瘤生长和转移依赖于肿瘤血管新生。 血管内皮生长因子家族成员 vascular endothelial growth facter family members, VEGFs 是影响肿瘤血管新生的关键因子之一。 VEGF-B是VEGF家族新成员， 在原发性肝癌等恶性肿瘤中存在高表达，目前研究表明VEGF-B可协同VEGF-A和其他血管生成因子，在肿瘤血管新生中发挥作用，但具体机制仍知之甚少。 siRNA 1998年由Fire等人首次提出。概念：一种由双链RNA double-stranded RNA, dsRNA 诱导的抗双链反应， 进而导致序列特异性的基因沉默 。 一种由20多个核苷酸组成的短片段双链RNA分子，按同源互补序列的mRNA为标靶从而使特定的mRNA降解。这种在转录后水平抑制基因表达的机制被称为RNAi机制 。 一种研究基因功能的利器，目前广泛应用于医学遗传学、分子生物学、疾病基因治疗等各方面的研究 。 肿瘤基因治疗的新思路：siRNA。 siRNA在恶性肿瘤基因治疗中的优点：高效性；高特异性；高稳定性。 实验设计思路 前人得出VEGF-B在肝癌细胞中存在高表达 在裸鼠体内试验中，VEGF-B与肝癌发生发展的关系 在裸鼠体内试验中， VEGF-B低表达对肝癌发生发展的影响 实 验 技 术 路 线 杀稻瘟菌素稳定筛选具有其抗性的HepG2细胞 扩增稳定筛选的HepG2细胞，注射到裸鼠皮下成瘤，并建立阴性对照 提取肿瘤组织VEGF-B mRNA，RT-PCR 统计实验数据，得出实验结论 观察各组裸鼠皮下种植瘤生长情况（体积、重量） VEGF-B靶向siRNA瞬时转染人肝癌细胞HepG2细胞 材 料 与 方 法 材料 人肝癌细胞株HepG2细胞，由河北医科大学第四医院科研中心提供 。 雌性无胸腺裸小鼠 4~5周龄，SPF级 ,购于中国医学科学院动物研究所