ARMS技术介绍重点分析.ppt

ARMS技术的介绍（the amplification refractory mutation system） 一、ARMS技术的原理二、ARMS技术的特点三、MGB探针及原理四、MGB探针的特点五、ARMS技术的应用六、ARMS实例：β-地中海贫血位点 主要内容 一、ARMS技术的原理 基本原理：TaqDNA聚合酶缺少3’-5’外切酶活性。在一定条件下PCR引物3’末端的错配导致产物的急剧减少，针对不同的已知突变，设计适当的引物可以通过PCR方法直接达到区分突变型和野生型基因的目的。 突变阻滞扩增系统（ARMS-PCR(amplification refractory mutation system)），又名等位基因特异PCR(allele specific PCR，ASPCR)。 ARMS技术针对引物3’端进行等位基因特异性的区分。 两种引物形式：“normal”野生型引物，扩增时会被突变的模板阻滞；“mutant”突变型引物，扩增时会被野生型模板阻滞。 一般情况下，通过引物3’端单个碱基的突变来区分等位基因效果并不理想。所以ARMS技术在大多数情况下还会人为的增加引物3’端附近的碱基的突变以达到区分等位基因的效果。 N-6 N-4 N-2 N N-3 以kappa casein基因的一个突变位点为例 二、ARMS技术的特点 2.1 ARMS技术具有高特异性。 由于ARMS所用的引物是从一段序列在3’末端及其附近人为的加入错配的突变位点的一套引物组合中，通过筛选出来的能够区分单个位点等位基因的引物，就保证了其高度的特异性: 2.2 ARMS技术具有高灵敏性 检测限可以达到100copies/mL，对于肿瘤组织检测限可以达到0.5%的突变率。 以BRAF V600E为例 ARMS 直接测序 2.3 检测时耗短，成本低，结果直观好判读 ARMS结合QPCR或者电泳技术，均只需进行一次PCR反应，时耗短。 ARMS技术需要优化的仅仅是上游引物，这相对于使用MGB探针的荧光定量PCR技术来说，成本低而且结果直观好判读。 三、Taqman MGB探针及其原理 Taqman MGB（Taqman minor groove binder）探针由普通taqman探针和MGB基团两部分组成。 Taqman-MGB RT-PCR原理 4.1 MGB探针的高Tm值 由于MBG基团对DNA双链小沟具有高的亲和性，因此在PCR反应中，MGB探针相较于普通探针Tm值要高很多，通常要高出10-20℃。 四、MGB探针的特点 4.2 MGB探针的特异性和灵敏性 MGB探针具有高的Tm值，可以很好的克服GC含量较低的模板的在探针设计时的困难，等位点突变序列间的Tm值相差很大，提高了检测的特异性。 同时，MGB探针包括一个不发荧光的猝灭基团（NFQ），它能真正消除传统猝灭基团产生的背景荧光，提高信噪比，从而提供检测灵敏性。检测下限可达到50copies。 4.3 MGB探针结果判读 定量实验：一对引物，一条MGB探针。一般用于目标位点的定量分析。 定性实验：一对引物，一对探针。一般用于等位基因突变位点的分型。主要使用等位点分型点阵来分析。 ARMS和MGB探针的比较 比较项目 ARMS MGB 需要的引物探针 一对引物，一条普通taqman探针 一对引物，一对taqman MGB探针 SNP位置 SNP位点位于上游引物3‘位点 SNP位点在探针序列中 前期优化成本及时长 优化上游引物，序列固定，成本较低，优化时间较短 优化探针序列，序列不固定，成本较高，优化时间较长 结果判读 根据CT差值或CT值有无来判读 通过等位点分型点阵，根据点阵分布判读 特异性来源 多条上游引物筛选出最优引物探针组合；CT差值>15保证等位位点间的差异 通过等位位点序列退火温度Tm值差异保证尽量消除了非特异扩增 灵敏性来源 前期优化时，通过控制模板量（100-1000copies）保证检测的下限 采用NFQ作为淬灭基团，消除背景信号，增强灵敏度 成品试剂盒成本 只需一条探针，且探针价格较低，成品试剂盒的成本低 需要两条探针，且探针价格较贵，成品试剂盒的成本高 五、ARMS技术的应用 5.1 ARMS技术结合电泳和QPCR技术。 目前采用电泳分析仍是主流，结合QPCR的还较少。 毛细管电泳 琼脂糖凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳 目前国内用ARMS技术拿证的试剂盒有三个：1、产品名称：人KRAS基因突变检测试剂盒(Taqman-ARMS法) 注册号：国食药监械(准)字2013第3400363号生产单位：苏州工业园区为真生物医药科技有限公司2、产品名称：人EGFR基因突变检测试剂盒(Taqman-ARMS法)