第5章目的基因制取范例.pptVIP

* 羟基磷灰石柱可吸附双链DNA、单链DNA，洗脱条件不同，0.27M磷酸缓冲液可洗脱双链，用0.12M磷酸缓冲液主要洗脱单链。 双链DNA和过量RNA被除去，单链DNA吸附在柱子上 * * Mung Bean Nuclease 绿豆核酸酶 * SSH法的PCR产物可直接标记成探针，混合探针可以用于全长CDNA文库的杂交，筛选差异表达基因的全长CDNA。 设计了一个用于逆转录的基因特异引物GSP-RT，进行逆转录，合成（-）cDNA。 用RNase降解RNA，然后用末端转移酶在（-）cDNA的3‘端加poly(A或C)尾 再用锚定引物合成第二链(+)cDNA, 接下来与3’ RACE过程相同。用接头引物和位于延伸引物上游的基因特异性引物GSP进行PCR扩增。 5’RACE ★ CIAP(牛小肠磷酸酶)除去5’磷酸，非全长mRNA的5‘端无法进行连接，而全长分子有5’-cap的保护 TAP（烟草酸焦磷酸酶）去除5’-cap，加入锚定引物，在RNA连接酶作用下将其连在全长mRNA 5‘端 嵌套PCR进行5’ RACE 连接酶介导的RACE ★ 通常的克隆方法是同时使用一个切点位于接头序列上的限制性内切酶和一个切点位于扩增区域内的内切酶。由于大多数非特异性扩增的cDNA产物不能被后一个限制性内切酶酶切，因而也就不会被克隆．从而增加了克隆的选择效率。 也可在基因特异性引物的 5’端掺人