第五章转基因动物与生物反应器OK重点分析.ppt

第五章 转基因动物与生物反应器 （五）体内接种 （1）在手术前夜令受体母鼠与已结扎输精管雄性小鼠合笼，次日晨取出雌鼠备用； （2）取注射吸管两支，分别作为向两侧输卵管注入胚卵之用；先吸入少许培养液， 排出后留少许液体并保留一两个气泡，继之吸入胚卵数个(在管腔内成串)； 最后仍保留一个气泡，以使管内胚卵限制于气泡之间不易移动并利于识别； （3） 麻醉小鼠，深度适当，置动物于小手术平台上，呈腹卧位(背朝上)； （4） 剪出背肾部两侧毛，碘酒／酒精消毒； （5） 使动物躯干部一侧斜向上，在髂骨和肾脏下方间剪一纵切口，长2cm； （6） 轻轻牵出输卵管，找寻输卵管口(刚排卵动物输卵管壶腹部微膨胀，内可见 成团未受精卵子)一手用镊子轻轻持住输卵管系膜，另一只手持一个含有胚 卵的注入管，伸入输卵管口内，把吸管内已含有外源DNA的胚卵全部注入 输卵管内； （7） 把输卵管及周围组织送回腹腔内； （8） 仔细紧密缝合创口， （9） 再令动物倒向另侧；按同样操作方法向该侧输卵管内输入同等量的胚卵。 （六）显微注射法获得转基因鼠的成活率 优点： 转基因范围广，转移基因大，可达数百kb；且转基因不含任何 病毒基因组片段，绝对安全 。 缺点：整合机制不明确，无规律随机整合，多拷贝整合导致转基因不 表达；整合位点随机会造成转动物基因组的重排、突变、易位缺 失等；需显微操作仪，技术性要求强。 二、胚胎干细胞方法 胚胎干细胞（embryonic stem cell，ES）是从早期胚胎内细胞团（ICM）分离出来的，能在体外培养的一种高度未分化的多能干细胞。 它是一种含正常二倍体染色体的具有发育全能性的细胞。 可以在体外进行人工培养，扩增，并能以克隆的形式保存。 （一）ES细胞的建立与维持 动物的准备：取受精之后3.5天的母鼠分离鼠胚。 胚胎的分离和初培养：3.5天孕鼠 鼠断颈处死 解剖小鼠取出胚胎 体外培养胚胎 4—6天后，离散ICM。 ICM的离散与ES的分离：分离ICM 酶解细胞团 培养离散细胞 ES细胞集落 ES细胞的扩增：离散ES细胞 置四孔培养板中培养 ES细胞的常规培养：ES细胞由四孔板转至培养皿进行常规培养 （二）ES细胞的基因组操作 将外源基因移入到ES细胞基因组后，既能高效稳定表达，又不影响ES细胞的各种功能。 这就要求目的基因必须要定点参入，并且参入整合后，对原有基因结构及功能没有影响或影响最小。 与整合位点两端区域同源的两段DNA序列（HB1和HB2） 转入的目的基因（TG） 编码抗G418的新霉素磷酸转移酶基因（neor） 两个不的胸苷激酶基因（HSV-tk1和HSV-tk2） （三）转基因ES细胞的筛选——正负选择法 正选择法筛选出转基因整合型ES细胞： 通过物理方法将重组DNA分子导入ES细胞，在含有抗菌素G418的培养基中，没有整合外源基因的细胞将全部死亡，只有整合了外源基因的细胞才可以存活下来。 负选择法筛选出特异整合型ES细胞： 如果非特异性整合发生，则两个tk基因或其中一个基因很大可能与TG和neor一起整合，这时用GCV筛选， tk基因表达的胸苷激酶能反GCV转化成有毒的化合物，使细胞死亡。这是负选反择。 （四）转基因ES细胞的检测 （五）转基因小鼠的繁育 正确整合的转基因胚胎干细胞经培养后就可以移入胚泡期的供体胚胎了。将这些胚胎移植到假孕的代孕母鼠子宫内，繁育转基因小鼠。 （六）获得纯合的转基因鼠 优点：基因转移效率大大提高，且能进行定位基因转移。 缺点：需要多代才能得到纯合的转基因动物，这对饲养成本高，产 仔数较少的大型哺乳类动物来说，要获得转基因动物是一件 需要大量资金投入的事情。 三、反转录病毒法 （一）反转录病毒感染法的原理 反转录病毒单链RNA分子； 病毒进入细胞后，RNA编码出反转录酶； 病毒RNA反转录为双链分子； DNA整合到宿主细胞DNA中。 （二）反转录病毒感染法的载体的构建 提取病毒未整合的环状形式DNA； 将环状DNA克隆到适当的载体中； 选择适当的酶将病毒结构蛋白编码区切除； 将外源目的基因克隆到载体中 （三）通过物理方法将重组DNA分子转入包装细胞 反转录病毒载体