第八章核素示踪在DNA测序中的应用范例.ppt

10月21日出版的《自然》杂志一期发表的报告说，人类基因数目为20000-25000，大大低于两三年前左右所估计的30000，更大大低于10年前左右所估计的10万。 INTERNATIONAL HUMAN GENOME SEQUENCING CONSORTIUM Nature 431, 931 - 945/21 October 2004  In 2001, the International Human Genome Sequencing Consortium reported a draft sequence of the euchromatic portion of the human genome. The international collaboration has worked to convert this draft into a genome sequence with high accuracy and nearly complete coverage. The current genome sequence contains 2.85 billion nucleotides interrupted by only 341 gaps. It covers 99% of the euchromatic genome and is accurate to an error rate of 1 event per 100,000 bases. Many of the remaining euchromatic gaps are associated with segmental duplications and will require focused work with new methods. The near-complete sequence, the first for a vertebrate, greatly improves the precision of biological analyses of the human genome including studies of gene number, birth and death. Notably, the human genome seems to encode only 20,000–25,000 protein-coding genes. The genome sequence reported here should serve as a firm foundation for biomedical research in the decades ahead. 第一节 基因组测序技术 一、测序流程 1. 构建生物基因组文库或cDNA文库 DNA的提取和制备→酶切制备克隆用DNA片段→与载体连接→转化受体细胞→筛选鉴定→扩增培养。 2. 从基因组文库中提取DNA大片段，进行测序： 将DNA用超声波（或限制性内切酶）切成能够测序的小片断(200-500bp)→小片断和载体结合，植入细菌中进行扩增（或用PCR扩增） →从细菌中提取出繁殖好的质粒→ 酶切，制取测序的DNA片段 3. 测序：上测序仪测序 。 4. 利用重叠技术，排出DNA大片段的序列。 二、 测序的基本方法 在分子生物学研究中，DNA的序列分析是进一步研究和改造目的基因的基础。 用于测序的技术主要有Sanger等（1977）发明的双脱氧链末端终止法和Maxam和 Gilbert（1977）发明的化学降解法。 异同点：这二种方法在原理上差异很大，但都是根据核苷酸在某一固定的点开始，随机在某一个特定的碱基处终止，产生A，T，C，G四组不同长度的一系列核苷酸，然后在尿素变性的PAGE胶上电泳进行检测，从而获得DNA序列。 （一）Maxam-Gilbert的化学降解测序法 基本原理:用化学试剂处理具有末端放射性标记的DNA片段，造成碱基的特异性切割并产生一组具有不同长度的DNA链降解产物，经凝胶电泳分离和放射自显影之后，可直接读出待测DNA片段的核苷酸序列。 测序步骤： ①先用限制性内切酶把DNA切成100~200bp 的测序材料； ②用碱性磷酸化酶处理该片段，消除5′末端上的磷酸； ③在5′-OH端标记32P，用多核苷酸磷酸激酶催化； ④标记片段变性为单链； ⑤化学试剂在特定碱基位置降解单链DNA， 产生一组长度不等的DNA片段； ⑥经电泳和放射性自显影后，从4个反应系统统一阅读， 待测DNA的全部核苷酸序列就可直接读出。 G反应： DMS使鸟嘌呤的7位氮原子甲基化，其后断开第8位碳原子和第9位氮原子间的化学键，哌啶置换了被修饰鸟嘌呤与核糖