SNAP-tag蛋白标记技术概要.ppt

SNAP-tag蛋白标记技术在生物学领域的的应用研究进展 生物物理学报 2014年6月 第30卷 第4期：251-263 背景 蛋白质是细胞的基本组成成分，是生命功能的体现者。研究蛋白质的结构、功能及其在细胞内的运动特征、相互作用和化学微环境等，对于了解细胞复杂的生命过程至关重要。 1.绿色荧光蛋白（green fluorescent protein, GFP）的发现及应用，是活细胞蛋白特异性标记方法发展的一个里程碑，它可以在不额外加入任何底物的情况下发出荧光，结合荧光成像技术可实现对活细胞内蛋白质的可视化监测。 缺点： GFP的荧光光谱较为单一，发光具有氧依赖性，且存在应答较为缓慢、灵敏度不高等。 2.SNAP-tag蛋白标记技术克服了以上缺点，具有较高的特异性、稳定性及配体的多样性，在蛋白标记等众多领域获得越来越广泛的应用。 SNAP-tag的设计原理 SNAP-tag蛋白中作为反应位点的半膀氨酸亲和进攻O6修饰的苯甲基鸟嘌呤的苄基，脱去鸟嘌呤结构后，半膀氨酸与苄基形成稳定的硫醚共价键，实现对靶蛋白的共价标记。 SNAP-tag的配体及功能 优点 SNAP-tag技术的应用 SNAP-tag在细胞内蛋白质性质与功能研究中的应用 1.蛋白质-蛋白质相互作用研究 (1)SNAP-tag荧光共振能量转移技术 Johnsson等将SNAP-tag及其突变体作为融合标签蛋白，成功应用于雷帕霉素介导的FKBP与雷帕霉素靶蛋白结构域的相互作用研究。 (2)SNAP-tag介导的选择性交联技术 Johnsson利用SNAP与BG之间不可逆的共价结合特点，设计了带有两个BG结构的交联剂，用于特异性、稳定交联两个SNAP-tag融合蛋白。 (3)SNAP-tag蛋白质片段互补分析技术 SNAP-tag蛋白由两个结构域组成，Mie等将其分裂成nSNAP和cSNAP蛋白片段的组装，分别与可能相互作用的两个蛋白融合，从而迅速恢复与SNAP-tag底物的反应活性，通过荧光检测两个蛋白是否相互作用。 2.蛋白质定位、运输的跟踪监测及动力学分析 细胞内的二氢叶酸还原酶常被融合于线粒体靶向序列，以用来研究线粒体输入的动力学过程，Krayl等通过构建细胞色素β2-DHFR-SNAP-tag融合蛋白分析了线粒体前体蛋白的运输过程。 3.体内蛋白质半衰期监测 展望 SNAP-tag技术的缺陷： 1.蛋白标签的分子量仍然较大，仅能与目标蛋白通过N端或C端融合，可能对某些融合蛋白的构象与功能产生影响 2.配体分子与SNAP-tag蛋白的结合虽具有较高的特异性，但受配体分子本身性质的影响，仍可能产生非特异性标记的干扰 在今后研究中，应以生物学研究为设计依据，以功能性配体分子的设计为基础，发挥SNAP-tag技术的独特优势，进一步发掘其潜在应用价值，使其在生物学领域具有更加广泛的应用。 * *