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免疫印迹原理 转膜 转膜方法及比较 “三明治”结构 常用膜及比较 转膜方法 方法 湿转 湿转是一种传统方法，将胶/膜叠层浸入缓冲液槽然后加电压。这是一种有效方法但比较慢，需要大体积缓冲液且只能用一种缓冲液。另外用这种方法转移2-D电泳中常规使用的大胶比较困难。湿转系统一般在恒压条件下进行，转移过程中混合缓冲液保持电流相对恒定。 半干转 用浸透缓冲液的多层滤纸代替缓冲液槽。因为电极板直接与滤纸接触，使凝胶中电场强度尽可能大以快速高效转移。与湿转相比，这种方法又快（15-45分钟）又好。多数半干转移方法使用一种以上的缓冲系统，可以同时高效转移大小不同的蛋白。然而，半干印迹系统因缓冲液较少不适于较长时间转移。对于大2-D胶的印迹，半干转移是理想选择。半干印迹仪一般使用恒流条件，转移过程中电压逐渐增加。半干转移系统中，滤纸和膜切成和凝胶相同大小，这样电流必须通过凝胶，否则，在凝胶边缘处滤纸重叠将导致电流短路。 封闭 封闭是为了使我们的抗体仅仅只能跟特异的蛋白质结合而不是和膜结合。 常用的封闭液有BSA，non-fat milk，casein，gelatin，tween-20等，我们一般用non-fat milk。 甲醇封闭 WB显色(HRP反应底物） 色原底物：在酶作用下产生一种新的颜色或者吸收光谱发生改变，：邻苯二胺(OPD），四甲基联苯胺(TMB)、5一氨基水杨酸(5-AS)、二氨基联苯胺（DAB）,邻联二茴香胺(ODA)、邻联甲苯胺(OT)等? 荧光底物：2-（2-苯乙烯基）-苯并噻唑 化学发光底物：①酰肼类，如鲁米诺(3-氨基苯二甲酰肼)，异鲁米诺(4-氨基苯二甲酰肼)及其衍生物；② 咪唑类，较常用的是2，4，5-三苯基咪唑，俗称洛酚碱；③ 吖啶盐类，最为常用的是N，N-二甲基吖啶硝酸盐(俗称光泽精)；④ 草酸盐类，该类化合物本身不是有效的化学发光剂，它和H2O2反应生成过氧化物中间体，而这种中间体是一个最佳的化学发光关键性中间体，它能释放出较多的能量，此能量可转移至加入反应体系的另一种物质的分子，使这种物质的分子激发而发光。这类化学发光反应的发光效率很高，例如双-(2，4，6-三氯基苯)草酸盐(TCPO) 。 ECL底物反应原理 反应底物为过氧化物+鲁米诺（5‘-氨基-2，3-二氢-1，4-酞嗪二酮） ，如遇到HRP，即发光，可使胶片曝光，就可洗出条带 胶片原理 曝光时，光能作用于卤素银（AgX）晶体，卤素银中的卤离子（X-）便失去一个电子而成卤原子（X），如图中的乙，其反应式如下：　　AgX + 光 = X + e + Ag+　卤化银 卤素 电子 银离子 　　所产生的自由电子，形成电子流在晶体中游动，当它们遇到感光中心时，就会被该中心所吸引，使该中心带上负电荷，当遇到负电场，便向感光中心集中，被中和成银原子。就如式子：　　Ag+ + e = Ag　　 银离子 电子 银原子　　当感光片的曝光量达到一定程度后，感光中心便因银的增加扩大而成显影中心，它是潜像的根据，所以生成卤元素，则被周围胶质吸收。 显影液原理 感光片和感光纸(相纸和放大纸)上的卤化银在光的作用下会发生分解，生成银原子和溴原子 AgBr →Ag+Br 这时感光片(纸)上形成的是潜影。潜影只有经过显影液的处理，才能变成可视影像。 显影液处理感光片(纸)是个化学过程。显影液使已感光的卤化银还原成金属银，变成黑色。感光片(纸)上感光多的部分，还原出的银粒多；感光少的部分还原出的银粒少。没有感光的部分不发生还原反应。这个过程就是显影。 定影液原理 定影的作用是把感光片上未受光和未受显影液作用的卤素银溶解掉，只保留已还原的银原子。因此定影剂要求能溶解卤素银，而不破坏已还原的银。 DAB染色反应原理 二氨基联苯胺（Diaminobenzidine,DAB）是辣根过氧化物酶最敏感、最常用的显色底物，反应产物因不溶于水、二甲苯和醇的棕色沉淀物而被广泛地用于WB、IHC和ICC、Dot blot和Biochip等的染色和显色反应。 方程式： 考马斯亮蓝法原理 1976年由Bradford建立,是根据蛋白质与染料相结合的原理设计的。这种方法是目前灵敏度最高的蛋白质测定方法之一. 考马斯亮蓝G-20染料,在酸性溶液中与蛋白质结合,使染料最大吸收峰位置,由465nm变为595nm,溶液的颜色也由棕黑色变为蓝色.染料主要是与蛋白质中碱性氨基酸和芳香氨基酸残基结合. 在595nm下测定的吸光度A595,与蛋白质浓度成正比. WB过程中常见的问题及