丙型肝炎病毒基因疫苗究进展.doc

丙型肝炎病毒基因疫苗研究进展 丙型肝炎病毒(HCV)是输血后肝炎的主要病原体，HCV急性感染后约50％-70%以上患者发展为慢性感染，其中部分病人可发展为肝硬化，甚至肝癌。迄今为止，对HCv慢性感染尚无高效特异性治疗方法，对IFN-α的治疗应答率只有15％~25％[1]。因此，寻求一种预防和治疗HCV感染的方法迫在眉睫。 基因疫苗又称为核酸疫苗或DNA疫苗，它是由病原体抗原的编码基因和作为真核细胞表达载体的质粒所组成。这种DNA既是载体又能在真核细胞中表达抗原，刺激肌体产生特异而有效的免疫应答，可有效预防病毒、细菌和寄生虫等所引起的疾病。DNA疫苗由于具有可诱发细胞免疫和体液免疫应答、能制备抗多价疫苗、兼有预防和治疗作用等优点，且与传统疫苗相比，DNA疫苗在细胞内表达的抗原具有天然构象，免疫原性良好，容易制备和运输，所以自上世纪90年代初问世以来，已在多种疾病的防治研究中显示出巨大的潜力[2-6]。HCV DNA疫苗是近年发展起来的新型疫苗之一，它是将HCVRNA上的某一特定片段克隆入适当的表达载体中再接种到体内，使目的基因得以表达，诱导机体产生特异的体液免疫和细胞免疫，以期达到预防和清除HCV感染的目的。本文就HCVDNA疫苗的类型、免疫效果的影响因素、作用机制及安全性等方面的研究进展作一综述。 l 不同类型HCV DNA疫苗的构建 1．1 HCV核心区DNA疫苗的构建 对来自不同基因型的HCV分析发现，其核心区(C区)基因片段高度保守，整个序列全长573核苷酸，编码含191个氨基酸的核心蛋白。Tokushige等[7]将全长C区片段克隆在包含有RSV启动子和CMV增强子的表达质粒中，构建pHCV2—2质粒，同时构建一个包括HCV 5’NCR和C区全部序列的pHCV4—2质粒，用磷酸钙沉淀法分别转染HuH—7细胞、RD细胞和G8细胞系。Western blot分析发现，3个细胞系中均表达21kd的核心蛋白。且Phv2-2质粒转染细胞的蛋白表达量明显高于pHCV4-2。单克隆抗体检测HCV核心蛋白为非分泌蛋白。用构建好的质粒肌肉注射BALB／C小鼠，小鼠对HCV C区蛋白体液免疫反应性较低，可能和C区蛋白非分泌有关。 为了评价小鼠体内CTL活性，Tokushige还建立了表达HCV核心蛋白的同基因SP2/0骨髓瘤细胞模型。和接种pHCV4—2质粒的小鼠相比，pHCV2—2质粒免疫的小鼠存活率明显增加、肿瘤的重量也明显降低，这表明pHCV2—2能引起较强的免疫应答。pHCV2—2质粒比pHCV4—2质粒的免疫效果为好，可能与Phcv2—2在细胞内表达的核心蛋白能诱导细胞免疫活性有关。 Major 等构建了表达HCV C区核蛋白前58个氨基酸的质粒 DNA—PC2N， 免疫Balb／c小鼠(下同)，在14同内均未出现抗体反应。而用该段基因与HBV的S基因，或与前S2基因构建嵌合DNA质粒，用同样方法免疫小鼠，结果均产生抗体反应，且可持续18周[8]。Lagging等用编码整个核壳蛋白(aa1-191)基因构建成DNA疫苗肌肉注射小鼠，均能引起血清抗体、脾细胞对合成肽C7—A10的增殖反应，且能诱导细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的杀伤活性[9]。 Ceissler等认为，HCV C区核壳蛋白能诱发机体产生广泛的体液和细胞免疫，这对清除HCV感染非常重要。在先前研究基础上，用HCV C区和HBV的前S1、前S2、S基因构建了9种不同重组体，转染不同细胞系，然后再免疫小鼠。结果显示，HCV C区蛋白及不同嵌合蛋白均可在转染细胞中表达，并可激发和增强小鼠CD4+T和CD8+T对HBV和HCV融合蛋白反应，免疫强度与CD4+T淋巴细胞产生的Th1样细胞因子水乎有关[10]。 1．2 HCV包膜区DNA疫苗的构建 HCV包膜区(E区)全长574—2427nt；分E1区(574一1149nt)和E2(1150一2427nt)，分别编码El、E2糖蛋白，其在病毒结合靶细胞方面起重要作用。Rosa[11]通过NOB(neutralization of binding)定量试验证实，HCV E2上至少存在可编码两种中和抗原从的基因片段，其一是位于E2区N端的高变区(high varible region，HRV)，另一片段独立于HRV以外，编码抗原能引起不同型HCV的交叉免疫反应。 Lee等[12]用编码192—364、384—719氨基酸残基的E1区和E2片段分别和HSV—I编码糖蛋白D的基因片段连接后克隆到pTV2质粒中，构建PTv2—SElt和pTV2-SE2t疫苗。胫前肌注射Buffalo小鼠，在小鼠体内分别产生抗体和淋巴细胞增殖反应，且pTV2-SE2t疫苗的免疫原性高于pTV2—SElt。为研究HCVE2片段不