讲稿-3.ppt

（5）对农杆菌侵染有敏感性 利用农杆菌Ti或Ri质粒为载体介导的植物基因转化，需要植物受体材料对农杆菌敏感。 ※ 不同的植物，甚至是同一植物的不同组织细胞对农杆菌侵染的敏感性有很大差异。因此，在选择农杆菌转化系统前必须测试受体系统对农杆菌侵染的敏感性，只有对农杆菌侵染敏感的植物材料才能作为受体系统。 2 、植物基因转化受体系统的类型及其特性 （1）愈伤组织再生系统 愈伤组织再生系统是指外植体经脱分化培养诱导愈伤组织，并通过分化培养能获得再生植株的受体系统。它具有如下特点： 1）细胞处于分生细胞状态，易于接受外源基因，因此转化率较高。 2）扩繁量大，可获得较多的转化植株。 3）外植体来源广泛，多种组织、器官均可诱导愈伤组织，甚至分化程度较深的组织、器官也能诱导出愈伤组织。 4）该再生系统几乎适用于每一种通过离体培养途径能再生植株的植物。 5）该再生系统获得的再生植株无性系变异较大，转化的外源基因遗传稳定性较差。 6）嵌合体多，这是由于从愈伤组织分化的不定芽常是多细胞起源。 （2）直接分化再生系统 直接分化再生系统是指外植体细胞越过脱分化阶段而直接分化出不定芽获得再生植株。用叶片、幼茎、子叶、胚轴等为外植体，直接出芽的研究已取得很多成功的事例，其特点如下： 1）获得再生植株的周期短，操作简单。 2）体细胞无性系变异小，较好地保持受体植物的遗传稳定性。转化的外源基因也能实现稳定地遗传，特别是由茎尖分生细胞建立的直接再生系统遗传稳定性更佳。 3）适于无性繁殖的园艺植物，如果树、花卉及某些木本植物，但对茎尖培养困难的粮食作物有一定局限性。 4）由外植体细胞直接分化芽比诱导愈伤组织困难得多，要使转化细胞直接分化成植株则更难。 5）由于不定芽的再生常起源于多细胞，因此直接再生系统同样出现较多的嵌合体。 （3）原生质体再生系统 原生质体是“裸露”的植物细胞。自从70年代初首次从烟草原生质体成功地培养出再生植株以来，至今已有250多种高等植物的原生质体培养获得成功，其中包括一些重要的禾谷类粮食作物如水稻、小麦、玉米等，这为基因工程利用受体系统打下基础，其具有以下特点： 1）原生质体被除去了细胞壁这一天然屏障，能够直接高效地摄取外源DNA或遗传物质，甚至细胞核。 2）通过原生质体培养，细胞分裂可形成基因型一致的细胞克隆。因此从转化原生质体获得的转基因植株嵌合体少。 3）原生质体转化受体系统易于在相对均匀和稳定的同等控制条件下进行准确的转化和鉴定。 4）由于原生质体培养周期长，因此细胞无性系的变异更为强烈，遗传稳定性更差。 5）原生质体培养难度大、再生频率低，还有相当多的植物原生质体培养尚未过关，因此其局限性也较大。 2、质粒载体 （1）Ti质粒载体 1）根癌农杆菌Ti质粒的结构与功能 Ti质粒是根癌农杆菌染色体外的遗传物质，为双股共价闭合的环状DNA分子，其分子量为95~156 x 106 D，约有200~300kb。依据Ti质粒诱导的植物冠瘿瘤种类的不同，Ti质粒可以分为四种类型：章鱼碱型、胭脂碱型、农杆碱型和农杆菌素碱型（agrocinopine）或琥珀碱型（succinamopine）。 1）T-DNA区 ( transfer-DNA region )：T-DNA是农杆菌侵染植物细胞时，从Ti质粒上切割下来转移到植物细胞的一段DNA；该片段上的基因与肿瘤的形成有关。 Ti质粒结构： 2）Vir区(Virulence region)：该区段上编码的基因能激活T-DNA转移，使农杆菌表现出毒性，故也称作致毒区。T-DNA区与Vir区在质粒上彼此相邻，合起来约占Ti质粒DNA的三分之一。 3）Con区（region encoding conjugations）：该区段存在与细菌间接合转移有关基因（tra），调控Ti质粒在农杆菌间转移。冠瘿碱能激活tra基因，诱导Ti质粒的转移，因此称为接合转移编码区。 4）Ori区（origin of replication）：该区段基因调控Ti质粒的自我复制。 》T-DNA的两端左右边界各为25bp的正向重复序列：BL和BR。 》25bp边界序列属保守序列，但通常右边界序列更为保守。 》边界序列的核心部分是14bp，可分为10bp（CACGATATAT）及4bp（GTAA）两部分，是完全保守的。 》左边界的缺失突变仍能致瘤，但右边界缺失则不再能致瘤，这时几乎完全没有T-DNA的转移，这说明右边界在T-DNA转移中是非常重要的。 2） 农杆菌T-DNA质粒的改造及载体构建 Ti质粒是植物基因工程的一种天然载体，但野生型Ti质粒直接作为植物基因工程载体存在许多障碍： （1）质粒过大（一般200kb左右），操作困