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H1N1猪流感病毒HA基因在毕赤酵母中的表达 　　摘要：利用 RT-PCR扩增H1N1亚型猪流感病毒HA基因，亚克隆到毕赤酵母表达载体pPIC9K中，构建分泌型重组表达载体pPIC9K-HA。将线性化的pPIC9K-HA电转化毕赤酵母菌GS115。将经MD平板筛选和PCR鉴定的阳性菌株用G418筛选多拷贝重组子。最后用1%甲醇诱导表达重组子，经SDS和Western-blot检测， H1N1亚型猪流感病毒HA基因在毕赤酵母中成功得到了表达，产物约60.4KD，并具有免疫活性。本研究为进一步研究猪H1N1亚型猪流感病毒HA基因的功能及检测方法奠定了基础。 　　关键词：高职；养禽与禽病防治；实践教学 　　中图分类号：S858.4+3 文献标识码：A 文章编号：1007-273X（2013）09-0005-03 　　猪流感（Swine influenza，SI）是由A型流感病毒所引起的猪的一种急性、高度传染性呼吸道疾病。临床特点为急性发热，传播迅速，发病率高，死亡率低，易引起继发感染，是危害养猪业的重要疾病之一。 随着集约化养猪规模的不断扩大，SI对养猪业构成了较大的威胁。自从1918年美国首次报道SI的暴发，1930年Shope从猪体中分离到HINl亚型SIV，迄今为止，SI已遍布亚、美、欧等地[1]。猪作为流感病毒的混合器，在流感病毒跨种属障碍而感染新宿主的过程中起着重要作用。2009年全球许多国家暴发了H1N1亚型流感，导致万余人死亡。SI严重威胁着人类健康，并直接关系到公共卫生及人类的生命安全。 　　血凝素（HA）的裂解活性为病毒具有感染性和病毒在宿主体内的传播所必需。HA基因在流感病毒识别靶细胞表面受体及穿膜过程中起重要作用，刺激机体产生的中和抗体可以抵抗病毒感染，还可以刺激机体产生细胞毒性淋巴细胞（CTL）反应[2]。因此，对HA基因编码的蛋白的研究具有重要意义。本试验克隆并在酵母表达了国内分离H1亚型猪流感病毒HA，为研究HA蛋白功能及建立SI诊断方法奠定基础。 　　1 材料与方法 　　1.1 质粒和菌（毒）株 　　大肠杆菌DH5α由本室保存；酵母-大肠杆菌穿梭质粒pPIC9K载体、毕赤酵母菌株GS115/His-4均购自Invitrogen公司；H1N1亚型猪流感病毒为本实验室分离保存。 　　1.2 试剂 　　大肠杆菌DH5α、酵母菌GS115感受态细胞、T4 DNA连接试剂盒购自爱思进生物科技有限公司；RNA 提取试剂盒、M-MLV逆转录酶试剂盒、DNA琼脂糖凝胶回收试剂盒购自Qiagen生物有限公司； DNA marker、蛋白质marker、限制性内切酶购自大连宝生物公司；酵母氮源YNB、G418购自北京普博欣公司；HRP标记的兔抗鼠IgG购自武汉博士德生物工程有限公司。试验中用到的引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，序列如下： 　　P1（扩增HA成熟肽基因上游引物）：ATCTACGTAGACACACTATGT（SnaBI） 　　P2（扩增HA成熟肽基因下游引物）：ATCGCGGCCGCATCATAAGTTCC（NotI） 　　α-factor：5-GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3 　　3AOX1：5-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3 　　1.3 培养基 　　大肠杆菌LB培养基、酵母生长培养基YPD、选择培养基MD以及酵母诱导表达培养基BMGY/BMMY均按美国Invitrogen公司的多拷贝毕赤酵母表达试剂盒的操作手册配制。 　　1.4 H1N1亚型猪流感病毒RNA的提取及反转录 　　H1N1亚型猪流感病毒RNA的提取及反转录试验分别按照按Qiagen RNAeasyTM 公司的RNA 提取试剂盒说明书及反转录试剂盒说明书进行。1.5 H1N1亚型猪流感病毒HA基因的扩增 　　以反转录合成的 cDNA 为模板，利用高保真度的Kod-plus DNA聚合酶和引物P1/ P2扩增HA基因片段，反应条件为94 ℃ 5 min；35个循环（94 ℃ 15 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s）；72 ℃延伸10 min，4 ℃终止反应。取 5.0 μl PCR 产物，用 0.8 %琼脂糖凝胶电泳检测鉴定后，将PCR回收产物送至上海生工生物工程有限公司测序。 　　1.6 克隆载体pMD18T-HA的构建 　　合成H1N1中截去N端信号肽序列的成熟肽基因（HA），用T4 DNA连接试剂盒将合成产物和克隆载体pMD18-T于16 ℃连接过夜，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布卡纳抗性平板，37 ℃培养至单菌落出现。小提质粒用SnaBI/ Not I双酶切鉴定，酶切正确的质粒命名为pMD18T-HA，送上海生物工程有限公司测序。