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Southern 印迹杂交实验报告姓名：陆 叶 学号：14211020062 专业：公共卫生实验时间：12.18；12.25 带教老师：潘銮凤【实验目的】学习核酸杂交的基本过程和操作【实验原理】将待检测的DNA分子用或不用限制性内切酶消化后，通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，继而将其变性并按其在凝胶中的位置转移到硝酸纤维素薄膜或尼龙膜上，固定后再与同位素或其它标记物标记的DNA或RNA探针进行反应，检测靶DNA片段中是否存在与探针同源的序列。如果待检物中含有与探针互补的序列，则二者通过碱基互补的原理进行结合，游离探针洗涤后用自显影或其它合适的技术进行检测，从而显示出待检的片段及其相对大小。 用途：检测样品中的DNA及其含量，了解基因的状态, 如是否有点突变、扩增重排等。【实验步骤】基因组DNA的限制性内切酶酶切取1个1.5ml离心管按下列量依次加入基因组DNA、10X酶缓冲液，酶，做好标记。老师给的HL60基因组DNA 10μg（7.6μL）；10×Buffer E（10.4μL）；EcoR I（10 u/μL）（2μL）。总体积20μL。 37℃保温1.5小时。2、1％琼脂糖电泳先制备凝胶，称取1.2 g Agarose放入三角烧瓶中，加入60 mL TAE溶液，微波炉中加热令其完全溶解，稍作冷却后加入GelRed核酸染液 6μL（稀释10,000倍）。浇板，水平放置，待凝。胶凝后按照以下顺序加样。两组共用一块凝胶，共7个样。基因组DNA10 20μl （自己的）基因组DNA10 μg（老师的）酶切样品阳性对照（c-myc 4.7 kb线性片段，30pg/μl, 10μl)酶切样品基因组DNA10 μg （老师的）基因组DNA10 20μl （自己的）插上电源，负极在样品槽一边，DNA将向阳极跑，80V电泳2小时左右，直到溴酚蓝染料跑到接近凝胶尾部，在电泳期间做好胶变性和转移准备。3、变性切胶，2—6孔，宽4.5cm,长7cm(从顶部开始，可用尼龙膜保护纸作为标尺）将凝胶浸在5倍体积的胶变性液中, 慢慢摇动20分钟。ddH2O洗2次。③在胶中和液中慢慢摇动15分钟。4、转移在搪瓷盘中加入300 ml 10×SSC，放上培养皿和小玻璃板。 将3张长滤纸浸湿，逐张放在玻璃板上，用移液管的滚动，赶走气泡。 切除多余凝胶，小心地将凝胶放在滤纸上（加样孔面向下），赶走滤纸与胶之间的气泡。再将与胶大小相同的尼龙膜（浸湿）放在胶上，同样不能有气泡，然后放上三张浸湿的滤纸，赶走气泡。紧贴凝胶四周各放一张X光片。 小心蒙上一张比搪瓷盘大的保鲜膜。保鲜膜要紧贴滤纸，但不能让滤纸移动。 用刀片在离滤纸周围约1-2 mm处，轻轻割断保鲜膜，但不能割破滤纸。取走滤纸上的保鲜膜。 整齐地放上草纸，数张草纸一折为二，草纸堆要高出搪瓷盘边约10 cm。 在草纸上放上玻璃板, 压上约500 g重的重物, 转移过夜。 5、固定 ①将胶和尼龙膜一起翻过来,用铅笔深入加样槽在尼龙膜上画上槽的位置 。 ②正面朝上放在紫外交联仪中，交联固定。 6、杂交和洗膜 ①将尼龙膜放入杂交管内, 加预杂交液, 68℃封闭6小时。 ②倒出预杂交液, 加杂交液 ，68℃杂交过夜。 ③回收杂交液 （可重复使用），将膜放在洗膜溶液I（2xSSC,0.1%SDS）中, 室温洗2次, 每次摇动5分钟。 ④再在洗膜溶液II（0.5xSSC, 0.1%SDS）中, 68℃洗2次, 每次摇动15分钟。 7、检测 将膜在缓冲液1(马来酸缓冲液)中漂洗3分钟。 在缓冲液2（封闭液）中室温摇动封闭30分钟。 在含anti-DIG-AP的抗体溶液中室温摇动，孵育30分钟。用洗膜溶液III（马来酸缓冲液，0.3%吐温）洗2次, 每次15分钟。在缓冲液3（检测缓冲液）中平衡3分钟。 将膜与新鲜配制的显色溶液一起在黑暗中温育0.5-16小时。当条带显色到合适的深度后, 或在膜背景变深前, 用TE或ddH2O洗去底物液，拍照并干燥保存。【实验结果】 上面两张图分别为琼脂糖凝胶电泳结果和Southern blot结果，琼脂糖凝胶电泳结果显示1-3条带（基因组DNA自己的；基因组DNA老师的；酶切样品）均有DNA片段显示，4阳性对照对应条带无DNA片段显示，1、2条带因为基因组很大，在电场作用下基本不会动，故在靠近加样孔的地方；而酶切后的基因组由于断裂成一系列的片段，电泳时会形成均匀的涂抹状，见条带3；尾巴高亮怀疑是RNA量过多；Southern blot 只显示了阳性对照结果。【注意事项】1、DNA限制性酶的用量1-5U/ugDNA，时间为1-20小时。中途可取少量（小于十分之一）电泳检测是否酶切完全。 2、EDTA会抑制酶活性，在酶解反应液中的浓度小于0.25mmol/l为佳。 3、内切酶一般保存在甘油中，甘油会抑制酶