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Western Blot中文版操作教程 1、 丙烯酰胺和 N，N’-亚甲双丙烯酰胺，应以温热(以利于溶解双丙稀酰胺)的去离子水配制含有 29%(w/v) 丙稀酰胺和 1%(w/v)N，N’-亚甲双丙烯酰胺储存液丙稀酰胺 29g，N，N-亚甲叉双丙稀酰胺 1g，加 H2O 至 100ml。)储于棕色瓶，4℃避光保存。严格核实 PH 不得超过 7.0，因可以发生脱氨基反应是光催化 或碱催化的。使用期不得超过两个月，隔几个月须重新配制。如有沉淀，可以过滤。 2、 十二烷基硫酸钠 SDS 溶液:10%(w/v)0.1gSDS，1mlH2O 去离子水配制，室温保存。 3、 分离胶缓冲液:1.5mmol/LTris-HCL(pH8.8):18.15gTris 和 48ml1mol/LHCL 混合，加水稀释到 100ml 终体积。过滤后 4°C 保存。 4、 浓缩胶缓冲液:0.5mmol/LTris-HCL(pH6.8):6.05gTris 溶于 40mlH2O 中，用约 48ml 1mol/L HCL 调 至 pH6.8 加水稀释到 100ml终体积。过滤后 4°C 保存。这两种缓冲液必须使用Tris 碱制备，再用 HCL 调节 PH 值，而不用 Tris.CL。 5、 TEMED 原溶液四甲基乙二胺催化过硫酸铵形成自由基而加速两种丙稀酰胺的聚合。PH 太低时， 聚合反应受到抑制。AP 提供两种丙稀酰胺聚合所必须的自由基。去离子水配制数 ml，临用前配制. 6. 10%过硫酸铵溶液： 称取 1g 过硫酸铵，加超纯水溶解并定容至 10ml，分装到 1.5ml 微量离心管 中，冻存。 7、 SDS加样缓冲液:在沸水终煮 3min 混匀后再上样，一般为 20-25ul，总蛋白量 100μg。 8、 Tris-甘氨酸电泳缓冲液:30.3gTris，188g 甘氨酸，10gSDS，用蒸馏水溶解至 1000ml，临用前稀 释 10 倍。PH8.3 9、 转移缓冲液： 2.9g 甘氨酸、5.8gTris 碱、0.37g SDS（可不加），200ml甲醇（临用前加），加水 至总量 1L。 10、 丽春红染液储存液：丽春红 S 2g 三氯乙酸 30g 磺基水杨酸 30g 加水至 100ml 用时上述储存 液稀释 10 倍即成丽春红 S 使用液。使用后应予以废弃。 11、 脱脂奶粉 5%(w/v)。 12、 NaN3 0.02% 叠氮钠(有毒，戴手套操作)，溶于磷酸缓冲盐溶液(PBS)。 4.2.4 22. 聚丙烯酰胺凝胶溶液： 分离胶 12.5% , PH8.8 5ml 10ml 15ml 超纯水 1.5ml 3.0 ml 4.5 ml 30%丙烯酰胺溶液 2.1 ml 4.2 ml 6.4 ml pH8.8、1.5mol/LTris 溶液 1.3 ml 2.6 ml 3.8 ml 10%SDS 0.05ml 0.1 ml 0.15 ml TEMED 0.002ml 0.004 ml 0.006 ml 10%过硫酸铵 0.05ml 0.1 ml 0.15 ml 浓缩胶：5% ，pH6.8 2 ml 4 ml 6 ml 超纯水 1.4 ml 2.8 ml 4.1 ml 30%丙烯酰胺溶液 0.3 ml 0.6 ml 1.0 ml pH6.8、1.0mol/LTris 溶液 0.25 ml 0.5 ml 0.75 ml 10%SDS 0.02 ml 0.04 m 0.06 ml TEMED 0.002 ml 0.004 ml 0.006 ml 10%过硫酸铵 0.02ml 0.04ml 0.06ml 一．配胶 1． 注意一定要将玻璃板洗净，最后用 ddH2O 冲洗，将与胶接触的一面向下倾斜置于干净的纸巾晾 干。 2． 分离胶及浓缩胶均可事先配好（除 AP 及 TEMED 外），过滤后作为储存液避光存放于 4℃，可至 少存放 1 个月，临用前取出室温平衡（否则凝胶过程产生的热量会使低温时溶解于储存液中的气体析 出而导致气泡，有条件者可真空抽吸 3 分钟），加入 10%AP（0.7~0.8:100, 分离胶浓度越高 AP 浓度 越低，15%的分离胶可用到0.5:100）及TEMED（分离胶用 0.4:1000, 15%的可用到0.3:1000，浓缩 胶用 0.8：1000）即可 3． 封胶：灌入2/3 的分离胶后应立即封胶，胶浓度＜10%时可用 0.1%的SDS 封，浓度＞10%时用 水饱和的异丁醇或异戊醇，也可以用 0.1%的 SDS。封胶后切记，勿动。待胶凝后将封胶液倒掉，如 用醇封胶需用大量清水及 ddH2O 冲洗干净，然后加少量 0.1%的SDS，目的是通过降低张力清除残留 水滴。 4．灌好浓缩胶后 1h 拔除梳子，注意在拔除梳子时宜边加水边拔，以免有气泡