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半定量 RT-PCR 方法一反转录—第一链 cDNA 的合成参照Promega RT-PCR试剂盒说明书进行。取2 μg植物 total RNA，与Oligo（dT）引物以0.5 ug primer/ug total RNA 的比例混合，体积不超过11 μL，70℃ 5 min，冰上冷却。加入各种反转录试剂混合：10× reverse transcript buffer 2.5 μL；RNase Inhibitor 0.5 μL；dNTP Mixture 2.0 μL；Reverse Transcriptase 1.0 μL；RNase free Water 补足 25 μL；混匀后，42℃ 1 h；75℃ 10 min。 PCR 合成第二链取第一链产物0.5 μL为模板，按常规PCR程序进行PCR扩增。以拟南芥Actin7基因为反应的内标对照。方法二反转录-聚合酶链反应（RT-PCR扩cDNA）第一步：1.0 μg拟南芥总RNA和1.0 μL oligo(dT) 引物，用水稀释到总体积5.0 μL的体系，70℃加热5 min后，迅速置冰上。第二步：在反转录作用下由随机引物引导反转录成cDNA第一条链。反应体系如下：表1 RT-PCR反应体系Table 1 The reaction system of RT-PCRMgCl2（25mM）5×Rxn BufferdNTP Mixture（25mM）rRNasin Ribonuclease inhibitor Reverse Transcriptase总RNA2.0 μL4.0 μL1.0 μL0.5 μL1.0 μL1.0 μg RNAtal25.0 μL反转录反应先在25℃下进行5 min，然后在42 ℃条件下进行50 min。转录反应物在70℃加热15 min后置于冰上，取反转录反应物的0.5 μL为模板，用如下的特异引物进行PCR反应。1.3.4 目的基因的获得1.3.4.1 PCR扩增目的基因PCR反应体系Table 2 The reaction system of PCR10×PCR Buffer(含Mg2+)10mM dNTP Mix10μM Prime R10μM Prime FcDNAE×Taq (5U/μL)ddH2O2.5 μL1.0 μL1.0 μL1.0 μL0.5 μL0.2 μL18.8 μLTotal25.0 μL按上表配制PCR反应液，反应条件如下：预变性95℃ 5 min；变性94℃ 50 sec，退火49～58℃ 60 sec，延伸72 ℃60～150 sec，32个循环；总延伸72℃ 10 min。Real time PCR方法一，单链cDNA的合成 单链cDNA的合成采用SYBR ExScriptTM RT-PCR kit (Perfect Real Time) (TaKaRa)试剂盒进行，具体操作如下：在冰上按如下表配制RT反应液： ReagentVolume（μL）0.5 μg RNATo 0.5 μg5×PrimeScriptTMBuffer2 μLPrimeScriptTM RT Enzyme MixⅠ0.5 μLOligo (dT) 12-18 (50 μM/L)0.5 μLRandom 6 mers (100 μM/L)0.5 μLRNase Free dH2OTo 10 μLTotal10 μL2. 将上述混合物置于42℃，15 min（反转录反应）；85℃，30 sec（反转录酶失活）。3. 得到的单链cDNA稀释10-100倍保存于-20℃。二， Real time PCR各cDNA样品分别用相关引物进行定量PCR反应。反应体系为20 μL：PCR ComponentVolume（μL）2×SYBR Primix Ex TaqTM10Primer F（10 μM）0.4Primer R（10 μM）0.4cDNA 模板2dd H2O7.2Total20反应条件如下：95℃10 s预变性，然后46次循环：95℃ 5 s, 60℃，43 s。融解曲线：63℃-95℃每0.5℃个温度梯度读板一次生成融解曲线，读板时间为2 s，每个样品3管重复。反应完成后，选择PCR base line substrated 模式进行数据分析和修正。以第四到第十五个循环荧光强度值标准差的十倍作为荧光阈值(Threshold value)，确定不同处理间的Ct值(Cycle threshold)。对于不同处理间的Ct值用SPSS统计软件进行差异显著性分析，用内标Actin7(At5g09810)进行标准化，计算各处理与对照间的Ct差值，用公式A＝（1＋X）△C(T) 计算基因表达的变化倍数。其中A表示表达改变倍数，X表示PCR扩增效率。TA连接