RT-RCR和RACE的区别.docxVIP

无论是RT-RCR还是RACE技术，无非都是先利用逆转录酶反转录成cDNA，再以cDNA为模板进行PCR扩增,而获得目的基因序列，其基本原理不外乎都是常规PCR技术的扩展。1、这两种方法有什么不同？首先是二者的“目的”不同：RT-RCR往往是为了扩增获得基因cDNA的“核心”片段，而RACE技术之所以称为(rapid-amplification ofcDNA ends)快速扩增cDNA末端：是通过RT-RCR的手段进行cDNA未知片段（末端）快速克隆的技术。目的有两个：根据已知序列RT-RCR产物获得未知cDNA序列；获得已知cDNA的山下端，即末端全长；其次是二者“手段”的不同：RT-RCR一般使用上下游双特异性引物进行PCR扩增，而RACE技术一般使用锚定PCR的方法：即一侧为通用接头引物，另一侧为基因特异引物GSP进行PCR扩增（因单引物特异性的局限性，RACE的过程中往往需要进行巢式PCR）总结一下：除了模版的不同外，二者的关系类似于“常规PCR技术”和“基因组步移技术”的区别！2、RT-PCR和RACE各在什么情况下用？首先：RT-PCR往往是在未知基因片段的情况下使用，利用物种之间的保守性设计(特异性或兼并)引物，获得特定物种某未知基因的核心片段（常规RT-PCR很难一次性获得基因全长）；RACE技术一般是在RT-PCR的基础上，根据已有序列的进行的，已经有人（包括我们课题组）也曾尝试过一步法RACE（在未获得核心片段的情况下，利用单边兼并引物直接扩增未知cDNA序列的末端全长，但是成功率很低）；其次：RT-PCR主要是为了获得核心序列，因此RT-PCR可满足于物种之间序列比对，适时定量（REAL-TIME)等研究的需要；而RACE技术主要是为了获得基因全长，因此可满足全基因蛋白质推导，基因的蛋白表达等研究需要；另外补充一点：5race存在着一定的局限。因为我们平时提RNA时，一般多少都有些降解，而RNA的降解是从5’端开始的，所以用5末端磷酸化的RTprimer去拉的时候，5末端往往不全，而且随着RNA链的增长，比如几K以上的，就更不能保证该prime能将5末端拉全。相对而言，3’race末端其实要好做很多，因为存在一个poly(A)，而且降解往往也不是从3末端开始的。所以一般情况下，这种方法也很常用，特别是在RT中。然而，也有局限性，如果你做的是细菌，那3末端就没有poly(A)，这个方法就不适用了，而且在有一些RNA中，这个poly(A)也很容易掉了。Takara的5 RACE和3 RACE的试剂盒的原理（见附图）。附：经典的RACE技术是由Frohman等(1988)发明的一项技术，主要通过RT-PCR技术由已知部分cDNA序列来得到完整的cDNA5’和3’端，包括单边PCR和锚定PCR。该技术提出以来经过不断发展和完善，克服了早期技术步骤多、时间长、特异性差的缺点(Frohman等,1995:Schaefer,l995: Chen,1998: Bespalova等,1998: Matz等11999)。对传统RACE技术的改进主要是引物设计及RT-PCR技术的改进:改进之一是利用锁定引物((lock docking primer)合成第一链cDNA,即在oligo(dT)引物的3端引入两个简并的核苷酸【5-Oligo(dT)16_30MN-3, M=A/G/C;N=A/G/C/T】，使引物定位在poly(A)尾的起始点，从而消除了在合成第一条cDNA链时oligo(dT)与poly(A)尾的任何部位的结合所带来的影响;改进之二是在5‘端加尾时，采用poly(C)，而不是poly(A);改进之三是采用RNase H一莫洛尼氏鼠白血.病毒(MMLV)反转录酶或选择嗜热DNA聚合酶可能在高温h (60 度 -70度 )有效地逆转录mRNA，从而消除了5‘端由于高CC含量导致的mRNA 二级结构对逆转录的影响;改进之四是采用热启动PCR (hot start PCR)技术和降落PCR(touch down PCR)提高PCR反应的特异性。RACE引物的设计：基因特异性引物（GSPs）应该是：??23－28nt??50－70％GC??Tm值≥65度，Tm值≥70度可以获得好的结果需要实验者根据已有的基因序列设计5‘和3‘RACE反应的基因特异性引物（GSP1和GSP2).由于两个引物的存在，PCR的产物是特异性的。必要时需进行巢式（二次）PCR;RACE技术（cDNA末端快速克隆技术）Time：2010-07-09 PM 21:30　Author:bioer　Hits: 1600 times 　 RACE(rapid-amplification of cDNA ends)是通过PCR进行cDNA末端快速克隆的技术，通