RNA提取和反转录.docVIP

RNA提取实验方法 1、准备工作：a、按照2.1.3.2收样方法，收取PH-1野生型分生孢子、菌丝（6h、12h、24h、36h）、9d子囊壳。b、200高温对研钵和研磨棒灭菌。c、电泳槽用3%的H2O2浸泡过夜后用去离子水洗净待用。d、用70%酒精将超净工作台和研磨样品所需的桌面擦洗干净。 2、将样品倒入液氮预冷的研钵中，迅速研磨（3次），待将要液氮挥发完全时，将样品粉末倒入RNA专用离心管内。加入1ml Trizol，涡旋震荡至混合均匀。 3、静置10min后，加入200μL氯仿上下翻转至混合均匀。 4、4，1000rpm离心15min 5、将上部澄清液转移到新的无菌的1.5ml离心管中，然后加入等体积与管内溶液的异戊醇。 6、静置15min后，4离心机10000rpm，15min。 7、倒去上清，加入1ml的75%乙醇。洗涤沉淀。 8、7500rpm，4，离心5min，倒去上部澄清液，置于超净台中吹干。 9、加入100-200μL的DEPC水溶解沉淀。 10、溶解后取5μL稀释10倍测RNA浓度。 11、电泳检测。 DNA的消解 1、在1.5ml离心管中配制以下反应体系： Total RNA 20 μg 10×DNaseI reacting buffer 10 μL DNase（RQ DNA se-free，DNase） 30 μL RNA free water至 100μL 2、37水浴30min。 3、分别加入400μL DEPC水和500μL的酚：氯仿：异戊醇（25:24:1），混匀后4，1000rpm离心10min。 4、将上部澄清液体转移至新的无菌的1.5ml离心管中，加入等体积于管内溶液的氯仿。上下翻转后4，1000rpm，10min。 5、将上部澄清液体转移至新的1.5ml的离心管中，加入2倍体积于管内溶液的100%乙醇后，置于-20冰箱过夜沉淀。 6、4，12000rpm，离心15min。 7、倒去上清，75%乙醇洗涤沉淀。 8、4，12000rpm，离心15min。 9、倒去上清，100%乙醇洗涤沉淀。 10、倒去上清，吹干后，加30μL DEPC水溶解。 11、溶解后，取出2μL测OD。 反转录 PCR管中加入： 模板RNA 1 μg Primer：digo（dT）18 primer 1μL DEPC水至 12μL 混匀后，微离心，置于65，5min。 将PCR管插于冰上冷却10min， 加入： 5×reaction buffer 4μL (20μ/μl)RibdockTMRNase inhibitor 1μL 10mM dNTP mix 2μL （200μ/μl）Reverse Transcriptase 1μL 混匀后，微离心，置于42，1h。 70，5min终止反应。-20保存。 RNA Isolation 准备工作 TRIZOL, Chloroform, Isopropyl alcohol, 75% Ethanol (in DEPC-treated water), DEPC-treated water 2ml tube (RNase free), 1.5ml tube (RNase free), PCR tube (RNase free), cut tips (RNase free) 步骤 HOMOGENIZATIONS Lyses tissues (around 0.1g) in liquid nitrogen and transfer it into 2ml tube Add 1ml TRIZOL as soon as nitrogen vaporizes Shake tubes vigorously to mix well Incubate the homogenized samples at RT for 5min PHASE SEPARATION Add 0.2ml of chloroform per 1ml of TRIZOL Reagent. Cap sample tubes securely, shake tubes vigorously for 15s Incubate them for 2~3min at 4℃ Centrifuge the samples at no more than 12,000g for 15min at 4℃ Transfer the aqueous phase (upper phase) to a fresh tube RNA PRECIPITA