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水产品免疫组化研究 　　摘 要：本文主要对免疫组化操作中的几个重要的环节，从取材固定、脱蜡、抗原修复、抗体的使用及显色等环节分别介绍了一些个人的经验和体会，希望对从事相同工作的同行有所帮助。 　　关键词：免疫组化；水产品；分析 　　中图分类号：F40 文献标识码：A 　　随着免疫组化技术在临床病理诊断中的不断深入和广泛应用，我们也在试图将它运用到更多领域的研究中，本文作者主要从事的就是水产动物内源性蛋白酶的免疫组化研究。由于免疫组化技术是一个复杂的生物技术，实验操作步骤也较繁琐，诸多的因素都可以影响到最终的染色结果，其中只要一步有问题就会影响最终结果的判定。笔者结合从事免疫组化研究以来的实践经验谈一下关于水产动物免疫组化的经验和体会，希望能对从事相同研究的同行有所帮助。 　　1 做免疫组化载玻片的准备 　　选用高质量的玻璃片作为免疫组化的载玻片，载玻片在使用前一定要用强酸洗液进行浸泡，之后用大量的蒸馏水冲洗干净，再用无水乙醇清洗一遍，之后用双蒸水冲洗干净，烘干后要经APES处理后使用，这样可以防止后续的处理过程中组织切片的脱落。载玻片的处理也是免疫组化中较为基础的一步，如果处理不好，最后的组织切片上会有黑点或其他不干净的东西，从而影响最终免疫组化染色切片的质量。 　　2 组织的取材和固定 　　组织的取材要根据自己的实际需要自行决定，不宜过大或者过小，因为免疫组化后续的处理过程中有高温加热抗原修复的步骤，所以组织取材不宜过大，约为0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm较为适宜，否则后续处理中组织块很容易脱落，造成后续的染色步骤无法正常进行；但是取材也不宜过小，否则显微镜下视野太小，不利于结果的判定。取材后的组织要及时的进行固定，同时还要选择适当的固定液，固定液的浓度和pH值也要把握好，我们一般选用的是10%的中性甲醛作为固定液，不恰当的固定液浓度会使组织的抗原性降低甚至消失，从而影响抗原的表达，导致检测不到阳性结果。同时，固定时间也要掌握好，时间的长短也会影响组织的抗原性。此外，固定不当还会影响到组织细胞的通透性，不利于后续染色中抗体的进入，适宜的固定时间一般是12-24小时。固定过程中还要确保组织块都浸没在固定液中。 　　3 石蜡切片的脱蜡处理 　　要想得到一张高质量的免疫组化染色切片，脱蜡处理也是其中较为关键和基础的一步。首先要在60℃下进行烤片30min，使石蜡融化，然后迅速放入60℃预热的二甲苯中，但是实践经验表明，有时在规定的温度和时间条件下，石蜡并不能很好的融化，此时要延长脱蜡时间或适当提高烤片温度，使石蜡能很好的融化，而且脱蜡的效果和室温也有很大的关系，冬天脱蜡时间相对就要长些，而夏天就可以适当短些。脱蜡后的组织切片如果发白，则说明脱蜡不彻底，这样会造成最终的免疫组化染色结果的背景过深，非特异性染色严重，影响结果的判定。 　　4 抗原修复 　　在免疫组化操作的整个过程中，抗原修复是其中一个极其关键的步骤，它的好与坏直接影响到最终结果的可靠性和真实性。由于组织经过中性甲醛或其他固定液固定和石蜡包埋后，组织内部的氨基酸残基容易形成分子内或分子间的醛键，使得抗原决定簇被封闭，抗原与抗体的结合位点减少，从而使抗原的阳性检测率及着色强度相对减弱。 　　抗原修复就是采用加热修复或高温高压的方式打破抗原决定簇之间的交联结构，使抗原决定簇重新暴露出来，以便更好的和抗体进行结合，从而提高免疫组化染色结果的阳性率。一般采用的是加0.01M，pH6.0的柠檬酸盐缓冲液，微波炉内进行抗原修复，但是微波火力要控制好，否则容易造成组织切片的破碎和脱落。个人经验认为，对于含肌原纤维较多的水产动物组织来说，微波火力可以适当高些，用中高火20～30 min即可，组织切片还可以保存的较完整；但是对于含胶原纤维较多的水产动物组织来说，由于组织比较脆弱，所以微波火力要适当降低，即先用中高火加热至微沸，之后要改用中火或中低火，时间也要减短，大概10-15 min即可。需要注意的是，加热过程中溶液不可沸腾，发现液体里有大量气泡产生应立即停止加热，稍冷片刻再继续加热。 　　5 抗体的稀释和保存 　　对于每一批新进的抗体，都应该按照厂家提供的建议稀释度，进行成倍稀释的预实验，如果厂家建议稀释度为1：50～1：100，那实验就要进行1：20，1：50，1：100，1：200的梯度实验，最终确定实验应选用的最适浓度。抗体的稀释要选用组织切片各步的清洗中的所用缓冲液进行稀释，而且要保持pH值的稳定，这样可以使抗体处于一种缓冲的状态中，更有利于抗原抗体的结合。抗体最好是现用现配，稀释后的抗体最好一次用完，而且不能反复冻融，因为这样会使抗体的效价降低，影响最终的免疫组化染色结果。 　　6 DAB显色 　　DAB显色剂的浓度和显色时间也是影