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生姜拮抗性内生细菌的筛选 　　摘 要：从乐山市售生姜根状茎中分离纯化内生细菌，并以金黄色葡萄球菌（Staphyloccocus aureus）、大肠杆菌 （Escherichia coli （E.coli））、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（Methicillin-resistant staphylococcus aureus，MRSA）为靶标菌进行抑菌试验。研究结果表明：生姜中存在大量的内生细菌，分离获得的9个菌株对四种靶标菌都有不同程度的抑菌作用，2个菌株（SJ1 and SJ9）抑菌效果非常显著，相对抑菌率超过170%。 　　关键词：生姜 内生细菌 分离 拮抗作用 筛选 　　中图分类号：S476 文献标识码：A 文章编号：1672-3791（2013）04（c）-0154-03 　　生姜（Zingiber officinale Roscoe）在中药中是一种很重要的药用植物，由于其性辛辣的特点，有发汗、驱寒、止呕、解毒等多种功能[1]，生姜中的一些代谢产物还具有良好的降胆固醇、抑菌、抗衰老、抗癌、防血凝、抗氧化及防腐等作用，如姜黄、姜精油[2]。生姜内生细菌是指存在于生姜组织和器官内部的细菌，根据相似相溶原理，生姜内生细菌可能具有生姜相同的抑菌效果[3]，可作为重要的天然抑菌材料来源进行研究。 　　由于生姜的病变很少，本研究基于生姜内生细菌可能具有抑菌功效的思想，从生姜组织中分离纯化内生细菌，并筛选对金黄色葡萄球菌（Staphyloccocus aureus）、大肠杆菌 （Escherichia coli）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（Methicillin-resistant staphylococcus aureus，MRSA）有抑菌作用的菌株，为利用植物内生细菌资源开发抑菌新药物提供理论依据。 　　1 材料与方法 　　1.1 材料 　　从乐山各市场购买市售食用生姜。 　　1.2 靶标菌 　　S.aureus、E.coli、B.subtilis、MRSA，由本校病理实验室提供。 　　1.3 培养基 　　马铃薯葡萄糖培养基（分离纯化培养基）：马铃薯200 g，葡萄糖5 g，琼脂粉16 g，纯净水1000 ml，pH自然[4]。 　　马铃薯琼脂培养基（PDA）（拮抗筛选培养基）：马铃薯200 g，削皮煮汁，葡萄糖5 g，琼脂粉20 g，水1000 ml，pH7.0[5]。 　　1.4 生姜内生菌的分离纯化 　　生姜的表面消毒：取无病无霉变的完整生姜块根（约30 g），用自来水冲洗5 min，冲洗表面的泥土等污物，放于已灭菌的培养皿中，无菌水反复冲洗3～5次，5%次氯酸钠洗涤3次，无菌水冲洗3～5次，收集最后一次冲洗液做无菌检验[6]。 　　分离纯化：在无菌条件下，分别用灭菌后的解剖刀切割表面消毒完全的生姜块根成直径为0.5 cm方形的小块，用无菌镊子将姜块放于马铃薯葡萄糖培养基上不同的地方，每个平板均匀摆放3～4块，置于28 ℃培养，每隔12 h观察一次，培养2～3 d时间。待培养皿上出现单菌落时，根据菌落的形态、颜色、大小将其分类后采用平板划线法接种到新鲜平板上培养，直到获得单菌落为止[7～8]，纯化后的菌株保存于斜面中备用。 　　1.5 平板对峙法初筛 　　内生细菌活化后涂布接种在平板上培养24 h后，在无菌条件下用0.5 cm打孔器制打成菌饼[9～10]，将菌饼放置于涂布接种有四种靶标菌的平板上，28 ℃培养，每隔12 h观察一次，培养48 h后用十字交叉法测定抑菌圈的大小[11～12]，每处理重复三次，以无菌的培养基打孔代替菌饼做为对照（CK）[13]。相对抑菌率（%）=（抑菌圈直径-菌饼直径）/菌饼直径×100%。 　　1.6 牛津杯法复筛 　　直接垂直插上已灭菌的牛津杯，轻轻加压（注意不能与培养皿底部接触）[14]，使其与培养基接触无空隙，每个平板插4个牛津杯，将初筛中有拮抗活性的菌株菌悬液100 ul加入到牛津杯中，置28 ℃培养48 h[15]，十字交叉法测量抑菌圈直径大小，记录数据。每种处理重复三次，以向牛津杯中加入100 ul的无菌水代替菌悬液做为对照（CK）。相对抑菌率（%）=（抑菌圈直径-菌饼直径）/菌饼直径×100%。 　　2 结果与分析 　　2.1 生姜内生细菌的分离纯化 　　通过反复分离纯化，并按照菌落、菌株形态、大小、颜色等特征进行区分，共获得9株可培养的内生细菌，依次编号为SJ1-SJ9。 　　2.2 拮抗菌株的初筛 　　对分离纯化得到的9株生姜内生菌菌株进行了皿内对峙法拮抗试验，9个菌株均具有不同程度的抑菌效果，其中有7个菌株对四种病原细菌的抑菌