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百合病毒的多重RT—PCR检测技术 　　摘要：根据百合（Lilium brownii var. viridulum）常见的黄瓜花叶病毒（CMV）、百合斑驳病毒（LMoV）、无症病毒（LSV）引物序列，设计2组特异引物，以18S rRNA为内参基因，采用多重RT-PCR，2组引物均能扩增得到LMoV和LSV预期大小一致的片段，未检测到CMV，检测结果不受病株取材部位的影响。该方法的建立为百合脱毒苗的规模化生产提供了高效检测技术。 　　关键词：百合（Lilium brownii var. viridulum）；病毒；多重RT-PCR 　　中图分类号：S682.2 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2013）20-5051-03 　　Studies on Multiplex RT-PCR Detection on Viruses of Lily 　　ZOU Ying-chun1，2，YANG Chao-zhu2，QIN Da-ji1，2，ZHAO Qing-hua2，XIANG Ji-qian1，2，YIN Hong-qing1，2， 　　YANG Yong-kang1，2，HUANG Jian-min1，2，PI Lei1，2 　　（1. Enshi Qingjiang Bio-Engineering Co.， Ltd.， Enshi 445000， Hubei， China； 2. West Comprehensive Experiment Station of Hubei Provincial Agriculture ST Innovation Center， Enshi 445000， Hubei， China） 　　Abstract： Based on the primers detecting lily （Lilium brownii var. viridulum） cucumber mosaic virus（CMV）， lily mottle virus（LMoV） and lily symptomless virus（LSV）， two groups of specific primers were designed. Using 18S ribosomal RNA as internal control gene， multiplex RT-PCR method were established to detect the 3 major viruses. LMoV and LSV were detected， but CMV was not detected. This detecting method will promote the large-scale production of the virus-free lily seedling. 　　Key words： lily（Lilium brownii var. viridulum）； virus； multiplex RT-PCR 　　百合（Lilium brownii var. viridulum）是百合科百合属多年生草本球根植物，主要分布在亚洲东部、欧洲、北美洲等北半球温带地区。我国栽培的百合种球主要依赖进口，长期的无性繁殖导致优良品种种球带毒严重，部分病毒感染率高达60%[1]。目前，国内外已报道侵染百合的病毒有20余种，其中黄瓜花叶病毒（Cucumber mosaic virus，CMV）、百合斑驳病毒（Lily mottle virus，LMoV）和百合无症病毒（Lily symptomless virus，LSV）是目前危害最大的3种主要病毒，它们单独和混合侵染可造成百合切花与鳞茎品质和产量的严重下降[1-5]。对这3种病毒的检测成为种球质量评估的关键，也是后续的分球和组培生产脱毒苗关键技术[6-9]。 　　目前，常见的百合病毒检测方法有电子显微镜法、血清学方法、分子杂交、反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）、血清学和PCR相结合的方法以及基因芯片法等。其中，RT-PCR方法被证实是目前特异性最强、灵敏度最高的病毒检测方法，现已广泛应用于病原诊断和检测。而后来发展起来的多重RT-PCR（multiplex RT-PCR）可以一次检测多种病毒，特异性强，灵敏度高，成为百合等常年无性繁殖作物病毒的高效检测方法。近年来湖北省恩施州百合产业发展较快，引进了不少国内外品种，但病毒的检测仍依赖于异地检测。因此，本研究旨在建立百合病毒的多重RT-PCR检测技术，为湖北省恩施州百合产业发展和脱毒种球种苗生产以及疫病监控提供技术支撑。 　　1 材料与方法 　　1.1 材料 　　百合病株样本采集自湖北省恩施州双河高山培育基