cDNA文庫的构建.docVIP

第二节??cDNA 文库的构建 ????cDNA 文库中的外源 DNA 片段是互补 DNA （complementary DNA , cDNA）。 cDNA 是由生物的某一特定器官或特定发育时期细胞内的 mRNA 经体外反转录后形成的双链 cDNA 。 cDNA 文库代表生物的某一特定器官或特定发育时期细胞内转录水平上的基因的群体，并不能包括该生物的全部基因，且这些基因在表达丰度上存在很大差异。 cDNA 文库的构建cDNA 文库的构建共分四步（图 8-2）：??第一，细胞总 RNA 的提取和 mRNA 分离；??第二，第一链 cDNA 合成；??第三，第二链 cDNA 合成；??第四，双链 cDNA 克隆进质粒或噬菌体载体并导入宿主中繁殖。??????图 8-2 ： cDNA 文库构建流程图 一、 RNA 的分离??? cDNA 文库构建是以 mRNA 为起始材料的， mRNA 在总 RNA 中所占比例很小，因此从总 RNA 中富集 mRNA 是构建 cDNA 文库和其它应用所必需进行的步骤。通过降低 rRNA 和 tRNA 含量，可大大提高筛选到目标基因的可能性。??? 目前纯化 mRNA 的方法都是在固体支持物表面共价结合固定一段由脱氧胸腺嘧啶核苷组成的寡聚核苷酸[ oligo（dT）]链，由它与 mRNA 的 Poly（A）尾巴杂交，从而吸附固定住